Neuropilin-1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因絨山羊模型的建立及其相關(guān)次級毛囊信號通路的研究.pdf

1、神經(jīng)纖毛蛋白1(Neuropilin-1.NRP-1)是一種跨膜糖蛋白。NRP-1作為一種新型的細(xì)胞表面受體，通過介導(dǎo)VEGF通路來促進血管的生成。實驗研究表明，NRP-1主要通過VEGFR-2途徑上調(diào)VEGF表達(dá)量。在NRP-1敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)血管的形成受到抑制。根據(jù)本實驗室初級毛囊和次級毛囊轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在初級毛囊和次級毛囊中NPR-1表達(dá)差異為3.16倍?；谝陨犀F(xiàn)象和理論，為了證實NRP-1在次級毛囊生長和發(fā)育中

2、的功能，本研究探討了建立過表達(dá)NRP-1轉(zhuǎn)基因阿爾巴斯白絨山羊模型的技術(shù)路線，同時運用質(zhì)譜分析、免疫共沉淀、Western Bolt、熒光定量PCR、哺乳動物雙雜交系統(tǒng)等技術(shù)手段，進一步探究NRP-1在次級毛囊生長中相關(guān)信號通路以及其功能。
　　1.NRP-1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因阿爾巴斯絨山羊模型的建立
　　構(gòu)建NRP-1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體，轉(zhuǎn)染至阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞，通過核移植方法，生產(chǎn)過表達(dá)NRP-1轉(zhuǎn)基因阿爾巴斯白絨山

3、羊胚胎。結(jié)果成功構(gòu)建了NRP-1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體，并且得到了33株陽性NRP-1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞系，用于體細(xì)胞核移植的研究。通過核移植得到154枚轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，并移植到55只受體羊中。雖然未得到陽性轉(zhuǎn)基因羔羊，但是上述結(jié)果對于阿爾巴斯白絨山羊轉(zhuǎn)基因體系的完善及相關(guān)動物模型的建立提供了實驗依據(jù)。
　　2.NRP-1相關(guān)次級毛囊信號通路的研究
　　由于阿爾巴斯白絨山羊生長周期較長，在建立NRP-1過表達(dá)阿爾巴斯轉(zhuǎn)基因白絨

4、山羊過程中，同步研究了NRP-1在次級毛囊中的信號通路。
　　在次級毛乳頭細(xì)胞中利用NRP-1沉淀與NRP-1相互作用的蛋白，通過SDS-PAGE電泳進行蛋白分離。經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白條帶，利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析檢測的方法鑒定蛋白的結(jié)構(gòu)。通過查閱文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫分析，得到Prdx2和CAT是有可能與NRP-1相互作用的蛋白。通過哺乳動物雙雜交系統(tǒng)確認(rèn)NRP-1與Prdx2存在相互作用的關(guān)系。并運用熒光實時定量PCR聯(lián)合蛋白免疫印跡法