骨髓增生異常綜合征患者骨髓TIM3+造血干細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:
　　通過(guò)研究骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic Syndrome，MDS)患者骨髓T細(xì)胞免疫球蛋白粘液素3(T-cell immunoglobulin and mucin-3，TIM3)陽(yáng)性造血干細(xì)胞數(shù)量、生物學(xué)特性，及其與骨髓髓源性抑制細(xì)胞(Myeloid-derivedsuppressor cells，MDSC)、外周血IFN-γ+CD4+T細(xì)胞和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞之間的關(guān)系，證實(shí)TIM3+干細(xì)

2、胞可能是MDS患者骨髓中惡性克隆細(xì)胞，且該群細(xì)胞與MDSCs擴(kuò)增，細(xì)胞免疫缺陷關(guān)系密切。對(duì)于TIM3成為鑒別MDS惡性克隆細(xì)胞的分子標(biāo)志物和MDS單克隆抗體治療的新靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　研究對(duì)象為天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院自2013年1月至2014年4月初治MDS患者及正常對(duì)照。第一部分研究MDS患者骨髓造血干細(xì)胞TIM3的表達(dá)情況。采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)49例初治MDS患者、22例初治AML患者（陽(yáng)性對(duì)照）及2

3、4名正常對(duì)照骨髓造血干細(xì)胞TIM3的表達(dá)情況，并分析MDS患者骨髓TIM3+干細(xì)胞數(shù)量與血細(xì)胞減少程度、骨髓原始細(xì)胞比例、MDS分型、核型分析、WPSS積分等臨床指標(biāo)的相關(guān)性。第二部分研究37例初治MDS患者TIM3+干細(xì)胞生物學(xué)特性，采用FCM檢測(cè)MDS患者骨髓TIM3+干細(xì)胞、MDS患者骨髓TIM3-干細(xì)胞與24名正常對(duì)照組TIM3-干細(xì)胞表達(dá)分化/增殖抗原(CD11b/CD71)、造血因子受體（TpoR、EpoR和G-CSFR）、

4、轉(zhuǎn)錄因子(GATA-1和GATA-2)及凋亡分子(AnnexinⅤ)的表達(dá)情況，分別從分化、增殖和凋亡方面評(píng)價(jià)MDS患者骨髓TIM3+干細(xì)胞的惡性生物學(xué)特征。第三部分研究MDS患者骨髓TIM3+干細(xì)胞數(shù)量與骨髓MDSC數(shù)量之間的關(guān)系。采用FCM檢測(cè)43例MDS患者及15名正常對(duì)照骨髓MDSC(Lin-HLA-DR-CD33+)數(shù)量，并分析TIM3+干細(xì)胞數(shù)量與MDSC數(shù)量之間的相關(guān)性。第四部分研究MDS患者骨髓TIM3+干細(xì)胞數(shù)量與外周

5、血IFN-γ+CD4+T細(xì)胞和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞之間的關(guān)系。體外活化淋巴細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)19例MDS患者和12名性別年齡匹配的正常對(duì)照外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)情況，并分析MDS患者TIM3+干細(xì)胞與IFN-γ+CD4+T細(xì)胞和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞數(shù)量之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　第一部分MDS患者骨髓CD34+CD38-Lin-細(xì)胞TIM3表達(dá)率明顯高于正常對(duì)照組(37.81％

6、 vs0.63％，P＜0.001)，與AML組接近(37.81％ vs33.15％，P=0.527); MDS患者TIM3+干細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(MFI)明顯高于對(duì)照組(51.29 vs4.69，P＜0.001)，與AML組接近(51.29 vs68.63，P=0.455)。對(duì)TIM3+干細(xì)胞與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，TIM3+干細(xì)胞與血紅蛋白水平(r=-0.378，P=0.009)呈顯著負(fù)相關(guān);與中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.

7、470，P=0.001）;血細(xì)胞減少受累系數(shù)越多，TIM3+干細(xì)胞數(shù)量越多(F=5.912，P=0.005);與骨髓原始細(xì)胞比例呈顯著正相關(guān)(r=0.364，P=0.014);在核型分析中，良性核型組(正常、del(Sq)和del(20q)，惡性核型組（復(fù)雜核型即大于等于3種核型異常，7號(hào)染色體異常）及中間核型組（除以上所述的核型）的TIM3+干細(xì)胞比例分別是:良性33.69±24.73％ vs惡性61.69±23.53％ vs中間40

8、.07±21.96％，三組間比較有顯著性差異（F=4.575，P=0.016）;隨著WPSS評(píng)分的逐漸升高，TIM3+干細(xì)胞的數(shù)量亦逐漸增多(F=4.176，P=0.002)。
　　第二部分MDS患者骨髓TIM3-干細(xì)胞與對(duì)照組TIM3-干細(xì)胞表達(dá)分化、增殖、凋亡相關(guān)抗原、造血因子受體及轉(zhuǎn)錄因子沒(méi)有顯著性差異，因此可將MDS患者TIM3-干細(xì)胞看作是相對(duì)正常的造血干細(xì)胞。再對(duì)MDS患者TIM3+干細(xì)胞與TIM3-干細(xì)胞進(jìn)行配對(duì)比較

9、:TIM3+干細(xì)胞低表達(dá)CDllb(17.38±12.56％ vs26.76±19.33％, P＜0.001)、TpoR(17.19±21.15％ vs.26.91±26.88％, P＜0.001)、EpoR(31.88±19.51％ vs.41.68±25.99％,P=0.009)、G-CSFR(38.99±24.51％ vs.47.30±24.15％, P=0.005);過(guò)表達(dá)CD71(48.03±22.57％ vs.30.81±2

10、3.87％, P＜0.001)、 GATA-2(64.04±22.90％ vs.47.20±25.48％, P＜0.001)。
　　第三部分 MDS患者骨髓MDSCs比例明顯高于正常對(duì)照組(1.79±0.56％ vs0.34±0.24％，P=0.014); MDS患者骨髓MDSCs的MFI明顯高于正常對(duì)照組(47.90±37.37 vs8.25±2.17，P＜0.001);MDS患者骨髓MDSCs比例與TIM3+干細(xì)胞比例呈顯著正

11、相關(guān)(r=0.556，P＜0.001)。
　　第四部分MDS組和正常對(duì)照組平均年齡及性別比例沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，MDS患者外周血IFN-γ+CD4+T/CD4+T比例明顯低于正常對(duì)照組(8.93±6.53％ vs23.87±8.83％,t=-5.508,P＜0.001),IFN-γ+CD4+T細(xì)胞數(shù)量與骨髓TIM3+干細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.579，P=0.009);MDS患者外周血IFN-γ+CD8+T/CD8+

12、T比例明顯低于正常對(duì)照組(18.28±13.74％ vs32.98±9.14％, t=-3.353，P=0.002)，IFN-γ+CD8+T細(xì)胞數(shù)量與骨髓TIM3+干細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.590，P=0.008）。
　　結(jié)論
　　(1) MDS患者骨髓TIM3+干細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，而與AML患者接近，TIM3+干細(xì)胞數(shù)量與MDS患者疾病進(jìn)展及不良預(yù)后密切相關(guān);
　　(2) MDS患者骨髓TIM3+干細(xì)胞具有

13、分化異常、過(guò)度增殖和凋亡減低的惡性生物學(xué)特征;
　　(3)MDS患者骨髓MDSC數(shù)量增多，并且與TIM3+干細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，提示TIM3+干細(xì)胞與MDSC的擴(kuò)增相關(guān);
　　(4) MDS患者外周血IFN-γ+CD4+T細(xì)胞、IFN-γ+CD8+T細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照組明顯減少，均與TIM3+干細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，提示TIM3+干細(xì)胞與細(xì)胞免疫功能低下關(guān)系密切。
　　(5) TIM3+干細(xì)胞可能既是惡性克隆細(xì)胞的“根源”，