骨髓增生異常綜合征惡性造血克隆的早期識別及根治研究.pdf

1、目的：
　　 從免疫表型、分子生物學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)等方面尋找與骨髓增生異常綜合征（Myelodysplastic Syndrome，MDS）惡性克隆負(fù)荷顯著相關(guān)的輔助診斷指標(biāo)，并在體外及體內(nèi)對不同方案治療MDS的機制及療效進行研究。
　　 方法：
　　 研究對象為MDS患者73例及正常對照12名。第一部分采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測白介素-3受體a（CD123）和粒細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte

2、Colonv Stimulating Factor，G-CSF）受體（CD114）在MDS患者骨髓中的表達情況，從免疫表型方面尋找MDS惡性克隆的分子標(biāo)志。第二部分采用半定量RT-PCR的方法檢測dlkl（delta-like1）基因在MDS患者骨髓中的表達情況，并分析其臨床意義，從分子生物學(xué)角度探尋惡性克隆的分子標(biāo)志。第三部分利用t檢驗、X2檢驗、Logistic回歸分析等統(tǒng)計方法分析MDS患者骨髓形態(tài)學(xué)、外周血象、鐵代謝等指標(biāo)與典型

3、染色體異常、惡性克隆負(fù)荷及分子遺傳學(xué)進展的相關(guān)性，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)等方面探索MDS惡性克隆的標(biāo)志。第四部分體外培養(yǎng)MDS患者骨髓粒.巨噬細(xì)胞集落形成單位（GM-CFU），14天后分別加入地西他濱、HA（高三尖衫酯堿+阿糖胞苷）、DA（柔紅霉素+阿糖胞苷）等藥物，采用FCM檢測72h后細(xì)胞的凋亡率及分化抗原CD11b、HLA-DR的表達，并采用RT-PCR檢測凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸蛋白酶3（caspase3）mRNA的表達，研究不同藥

4、物對MDS患者GM-CFU的作用及機制。第五部分將MDS患者根據(jù)國際預(yù)后積分系統(tǒng)（IPSS）評分分為中低危組和高危組，對依據(jù)不同危險度實施的分層治療療效進行分析。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分、MDS患者骨髓CD34+細(xì)胞分化異常，CD34+CD38-/CD34+比例（（14.034±5.27）％）顯著高于對照組（（7.704±4.36）％）（P<0.01）；MDS患者骨髓CD123+CD34+CD38-/CD34+CD

5、38-表達率為（48.39±28.15）％，顯著高于對照組（（8.754±11.71）％）（P<0.01），全血細(xì)胞減少患者的CD123表達率（（63.15±23.84）％）顯著高于一系（（19.30±8.65）％）及兩系（（32.32±22.93）％）血細(xì)胞減少者（P均<0.01），染色體異?；颊叩腃D123表達率（（54.294±24.72）％）顯著高于染色體正常組（（35.404±29.07）％）（P<0.05），CD123+CD

6、34+CD38-/CD34+CD38-表達率與骨髓原始細(xì)胞比例（r=0.457，P<0.05）及惡性克隆負(fù)荷呈顯著正相關(guān)（r=0.357，P<0.05）； CD123+CD34+CD38-細(xì)胞的CD114表達率為（34.82±29.58）％，顯著低于CD123+CD34+CD38-細(xì)胞中的CD114表達率（（53.48+27.41）％）（P<0.05），表型為CD123+CD34+CD38-的細(xì)胞可能是MDS的惡性克隆細(xì)胞。
　　

7、 第二部分 dlk1基因在MDS患者骨髓單個核細(xì)胞（BMMNC）中的表達量為0.7342±0.3652，顯著高于對照組（0.4801±0.1759）（P<0.05）；隨MDS亞型進展，dlk1基因表達量顯著增高（P<0.05）；dlk1基因表達量與骨髓原始細(xì)胞比例呈顯著正相關(guān)（r=0.467，P<0.05）；染色體異常組的dlk1表達量（0.9007±0.4334）顯著高于染色體正常組（0.6411±0.2630）（P<0.05）；d

8、lk1表達量較高（≥0.8）組的平均惡性克隆負(fù)荷（0.4134±0.3999）顯著高于dlk1表達量較低（<0.8）組（0.1517±0.3109）（P<0.05）。
　　 第三部分、MDS患者常見的染色體核型異常由多至少依次為-7、+8、+21/-21、-5/5q-、-Y等。特征性病態(tài)造血與典型染色體異常的相關(guān)性包括：雙核粒細(xì)胞、紅細(xì)胞緡錢狀與-7顯著相關(guān)；雙核粒細(xì)胞與-5/5q-顯著相關(guān)；粒細(xì)胞分葉不良與-20/20q-顯著

9、相關(guān)（P均<0.05）。MDS高惡性克隆負(fù)荷的指征包括：A組（骨髓涂片見到奇數(shù)核紅細(xì)胞、外周血出現(xiàn)幼稚細(xì)胞）、B組（骨髓涂片見到雙核粒細(xì)胞、粒細(xì)胞分葉不良、骨髓三系病態(tài)造血、PAS陽性、血清鐵蛋白≥220ng/mL、不飽和鐵結(jié)合力（UIBC）<40umol/L）。滿足A組兩個條件，或滿足A組其一同時滿足B組兩個及以上條件，或滿足B組4個及以上條件者具有顯著較高的惡性克隆負(fù)荷（P<0.01）。MDS患者分子遺傳學(xué)進展的危險因素包括：骨髓涂

10、片可見奇數(shù)核紅細(xì)胞、粒細(xì)胞巨幼樣變及高髓系分化指數(shù)（Differentiation Index，DI）（P<0.05）。
　　 第四部分、地西他濱可誘導(dǎo)MDS細(xì)胞凋亡，經(jīng)1.6mmol/L、3.2mmol/L、6.4mmol/L地西他濱作用后，細(xì)胞凋亡率為別為（21.969±10.187）％、（24.2464±9.053）％、（26.438±10.742）％，顯著高于對照組（13.965±3.503）％（P均<0.05），呈濃度

11、依賴性；地西他濱同時可促進細(xì)胞分化，經(jīng)3.2mmol/L、6.4mmol/L地西他濱作用后，細(xì)胞表面分化抗原CD11b表達率分別為（43.546±11.222）％、（46.8544±10.347）％，均顯著高于對照組（（31.1964±12.839）％）（P均<0.05）。經(jīng)HA作用后，細(xì)胞凋亡率為（32.048±9.525）％，顯著高于對照組（（13.965±3.503）％）（P<0.05），死亡率（（31.550±9.514）％）亦

12、顯著高于對照組（（7.399±5.990）％）（P<0.05）。經(jīng)DA作用后，細(xì)胞死亡率（（55.396±16.063）％）顯著高于其他各組（P<0.05），凋亡率（（4.664±4.074）％）、CD11b表達率（（14.422±14.921）％）均顯著低于其他各組（P均<0.05）。
　　 第五部分、根據(jù)不同危險度實施分層治療是MDS治療的主導(dǎo)思想；中低危組患者應(yīng)用造血刺激因子（Htematopoietic Stimulat

13、ing Factor，HSF）治療的總有效率（74.4％）及總顯效率（65.1％）均顯著高于不用HSF組（有效率36.4％、顯效率18.2％）（P均<0.05），貧血患者應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）治療的血紅蛋白顯效率（28.6％）顯著高于不用EPO組（0％）（P<0.05），粒細(xì)胞減少患者應(yīng)用G-CSF治療的中性粒細(xì)胞有效率（69.0％）顯著高于不用G-CSF組（20.0％）（P<0.05）；IPSS高危

14、組MDS及MDS轉(zhuǎn)白患者首選IA（去甲氧柔紅霉素+阿糖胞苷）方案化療，地西他濱治療MDS的療效初步觀察較好，仍有待于大樣本量的長期觀察。
　　 結(jié)論：
　　 （1）MDS患者高惡性克隆負(fù)荷的指征包括：CD123高表達、dlk1基因高表達、骨髓涂片可見奇數(shù)核紅細(xì)胞、外周血可見幼稚細(xì)胞；
　　 （2）MDS患者特征性病態(tài)造血與典型染色體異常的相關(guān)性包括：雙核粒細(xì)胞和紅細(xì)胞緡錢狀與-7顯著相關(guān)、雙核粒細(xì)胞與-5/5q-