內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化在纖維化疾病中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　目的：體外建立血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?br>　　方法：取健康胎兒臍帶，采用體外酶消化法分離培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中凝血因子Ⅷ的表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中鈣黏蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)為圓形、短梭形或扁平形，傳代后細(xì)胞形態(tài)與原代類似，細(xì)胞呈鋪路石樣旺盛生長(zhǎng)。(2)原代培養(yǎng)和傳代后細(xì)胞均表達(dá)凝血因子Ⅷ，

2、但傳代后細(xì)胞凝血因子Ⅷ陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于原代培養(yǎng)(F值為7.481，P<0.05)。(3)原代培養(yǎng)和傳代后細(xì)胞均表達(dá)鈣黏蛋白。
　　結(jié)論：證實(shí)體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞為HUVEC。
　　第二部分：TNF-α調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的；觀察TNF-α在血管內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用，以探討纖維化疾病發(fā)生的新機(jī)制。
　　方法：取第3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC，分別接種于12孔板、6孔板和6cm板

3、中，12孔板和6孔板按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：對(duì)照組，培養(yǎng)液不加其他刺激因素，5、10、25、50、100ng/mL TNF-α組，分別在培養(yǎng)液中加相應(yīng)終濃度TNF-α；6cm板按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對(duì)照組，培養(yǎng)液不加其他刺激因素，5、25、50ng/mL TNF-α組，分別在培養(yǎng)液中加相應(yīng)終濃度TNF-α。每組3個(gè)樣本。72 h后倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)；免疫熒光法檢測(cè)12孔板中各組細(xì)胞凝血因子Ⅷ和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)

4、的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)6孔板中各組細(xì)胞鈣黏蛋白、β-SMA和Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)；免疫印跡法檢測(cè)6cm板中各組細(xì)胞鈣黏蛋白、α-SMA表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)為圓形、短梭形或扁平型，細(xì)胞間連接緊密，5、10、25、50、100ng/mL TNF-α組隨著TNF-α濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸由圓形、短梭形和扁平型向長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞間連接減少、間隙變大。(2)TNF-α組細(xì)胞中凝血因子Ⅷ、α-SMA雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比值均顯

5、著高于對(duì)照組(F值為45.009，P<0.01)。(3)5、10、25、50、100ng/mL TNF-α組細(xì)胞中鈣黏蛋白mRNA表達(dá)水平逐漸降低，后4組細(xì)胞中鈣黏蛋白mRNA水平顯著低于對(duì)照組(F值為11.593，P<0.05或P<0.01)：而α-SMA和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平逐漸增高，后3組細(xì)胞中α-SMA和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(F值分別為7.839、2.898，P<0.05或P<0.01)。(4)5、25、5

6、0 ng/mL TNF-α組細(xì)胞中鈣黏蛋白的表達(dá)量逐漸降低，后2組水平顯著低于對(duì)照組(F值為66.551，P<0.05或P<0.01)；而α-SMA表達(dá)量逐漸增加，各組水平均顯著高于對(duì)照組(F值為12.335，P<0.05或P<0.01)
　　結(jié)論：TNF-α呈明顯的濃度依賴性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提示這可能是慢性炎癥疾病、瘢痕形成中和纖維化組織內(nèi)肌成纖維細(xì)胞的又一重要來源，促炎癥細(xì)胞因子是促進(jìn)這一轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵誘因。

7、r>　　第三部分：白細(xì)胞介素-6在血管內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用
　　目的：觀察IL-6在血管內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用，探討纖維化疾病發(fā)生的新機(jī)制。
　　方法：取第3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC分別接種于12孔板、6孔板和6cm板中，12孔板和6孔板按隨機(jī)數(shù)字表法均分為6組：對(duì)照組，培養(yǎng)液中不加其它刺激因素，5、10、25、50、100ng/mL IL-6組，分別在培養(yǎng)液中加相應(yīng)終濃度IL-6；6cm板按隨機(jī)數(shù)字表法

8、均分為4組：對(duì)照組，培養(yǎng)液中不加其它刺激因素，5、25、50ng/mL IL-6組，分別在培養(yǎng)液中加相應(yīng)終濃度IL-6。每組3個(gè)樣本。培養(yǎng)72 h后倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)；免疫熒光法檢測(cè)12孔板中各組細(xì)胞凝血因子Ⅷ和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)6板中各組細(xì)胞鈣黏蛋白、α-SMA和Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)；免疫印跡法檢測(cè)6cm板中各組細(xì)胞黏蛋白、α-SMA表達(dá)。對(duì)數(shù)據(jù)行單因素方差分析及兩兩比較LSD檢驗(yàn)。

9、
　　結(jié)果：(1)對(duì)照組細(xì)胞呈圓形、短梭形或扁平型，細(xì)胞間連接緊密；5、10、25、50、100ng/mL IL-6組細(xì)胞隨著IL-6濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸由圓形、短梭形或扁平型向長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞間連接減少、間隙增寬，細(xì)胞胞體變大、呈旋渦樣生長(zhǎng)。(2)對(duì)照組中凝血因子Ⅷ、α-SMA雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比值顯著低于各IL-6組(F值為79.72，P<0.05或P<0.01)。(3)5、10、25、50、100 ng/mL IL-6組鈣黏蛋

10、白mRNA表達(dá)水平逐漸降低，后4組鈣黏蛋白mRNA水平顯著低于對(duì)照組(F值為24.637，P<0.05或P<0.01)；α-SMA和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平逐漸增高，后4組α-SMA mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(F值為23.955，P<0.05或P<0.01)，100 ng/mL IL-6組Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(F值為2.250，P<0.05)。(4)IL-6組鈣黏蛋白的表達(dá)水平逐漸降低，各組表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(