新型突變mucA基因編碼蛋白的亞細胞定位、對生物被膜形成的影響及其機制的探討.pdf

1、目的：探討新型突變mucA56基因編碼蛋白的亞細胞定位，并觀察mucA56基因對生物被膜形成的影響，探討mucA56基因影響生物被膜形成的機制。
　　 方法：采用含NcoI和XbaI 酶切位點的引物，從Pmd18t-HR擴增mucA56基因的全長克隆到Pmf54構建Pcaq56，XbaI單酶切Ppho7載體中的堿性磷酸酶基因全長插入到Pcaq56的開放閱讀框中，構建mucA56-phoA融合表達載體Pcaq57。對構建的Pcaq

2、57載體進行PCR鑒定及序列測定，并使用堿性磷酸酶抗體驗證融合蛋白的表達。將Pcaq57、Pkmg170(陰性對照質粒)、Pkmg176（陽性對照質粒）分別轉化大腸桿菌和銅綠假單胞菌，劃線接種在含有堿性磷酸酶作用底物BCIP的LB瓊脂平板上，觀察各自菌落顏色以評估堿性磷酸酶活性；從pGFPuv質粒中擴增表達增強型綠色熒光蛋白的基因全長，克隆入大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭質粒（Pucp20），構建一個穩(wěn)定的銅綠假單胞菌綠色熒光蛋白表達載體（

3、Pucp20/GFPuv），采用電轉化的方式將Pucp20/GFPuv導入到銅綠假單胞菌PAO1、PDO300(含經典突變mucA22基因的粘液型PAO1同源菌株）、PAOmucA56（含新型突變mucA56基因的粘液型PAO1同源菌株）中，采用改良的流動介質體外培養(yǎng)生物被膜，應用激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜形成第1、3、5天的形態(tài)和結構；收集三者生物被膜形成第一、三、五天的生物被膜細菌，提取細菌全蛋白進行蛋白質二維電泳，找出PAO1、

4、PAOmucA56表達水平相同而與PDO300表達水平差異的蛋白點，采用基質輔助的激光解吸/電離飛行時間(MALDI-TOF MS)分析差異蛋白質。
　　 結果：對構建的融合表達載體Pcaq57進行PCR鑒定及序列測定，結果表明phoA基因正向插入到mucA56的開放閱碼框中；Western Blot進一步證實了融合蛋白的表達；以上提示成功構建了mucA56-phoA融合蛋白表達載體Pcaq57。轉化了Pcaq57的大腸桿菌和銅

5、綠假單胞菌，以及轉化了Pkmg170的大腸桿菌和銅綠假單胞菌，在含有堿性磷酸酶作用底物BCIP的LB瓊脂平板上，均表現為白色菌落，提示為無活性的堿性磷酸酶活動。而轉化了Pkmg176的大腸桿菌和銅綠假單胞菌，在含有堿性磷酸酶作用底物BCIP的LB瓊脂平板上均表現為藍色菌落，提示為有活性的堿性磷酸酶活動；激光共聚焦顯微鏡觀察PAOmucA56、PAO1、PDO300第1、3、5天生物被膜形態(tài)，結果顯示：PAOmucA56、PAO1的形成方

6、式為水平鋪散，其成熟生物被膜形態(tài)為均一的薄膜狀，基質覆蓋完全，PAOmucA56成熟生物被膜平均厚度約為30mm，PAO1成熟生物被膜平均厚度約為25mm；PDO300的形成方式為局部堆積，呈山丘狀，成熟生物被膜具有很大的異質性，以低的基質覆蓋和大的微生物菌落間隔為特點，生物被膜最高厚度約為36mm。生物被膜形成第一天、第三天、第五天的生物被膜細菌全蛋白二維電泳，PAO1和PAOmucA56表達相同而與PDO300差異表達的蛋白點分別有

7、8個、6個、15個。29個蛋白的質譜分析結果表明，有12個蛋白的質譜分析結果可信度不高（MS﹤66）。篩選出來的17個候選蛋白中，DNA指導的RNA聚合酶b亞單位、谷氨酰胺合成酶、延長因子Tu、DNA指導的RNA聚合酶a亞單位、內肽酶Clp2、延長因子G1、熱休克蛋白 HtpG、ATP依賴的Clp蛋白ATP結合亞單位 clpX、觸發(fā)因子在PDO300中相對低表達，而30S核糖體蛋白S18、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、丙酮酸脫氫酶復合物二氫硫辛

8、酰賴氨酸基乙酰轉移酶、PasP、生物素羧化酶、精氨酸脫亞氨酸、鳥氨酸氨甲酰轉移酶、絲氨酸羥甲基轉移酶3在PDO300中相對高表達；其中clp蛋白酶家族（內肽酶Clp2和ATP依賴的Clp蛋白ATP結合亞單位 clpX）分別在第三天、第五天生物被膜細菌中有PDO300的相對低表達。
　　 結論：mucA56基因編碼的產物定位在細胞質；藻酸鹽可以影響生物被膜結構，而mucA56基因存在藻酸鹽以外的途徑影響生物被膜的形成；mucA56