Myostatin下游靶基因c-RZF的研究.pdf

1、肌肉生長(zhǎng)抑制素myostatin(Growth and Differentiation Factor-8，GDF-8)是TGF-β(Transforming Growth Factor-β)超家族的成員之一。Myostatin高表達(dá)于骨骼肌中，其基因敲除將導(dǎo)致骨骼肌的增生(hyperplasia)與肥大(hypertrophy)，而其它各組織未有明顯變化，因此作為骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮作用。作為一種細(xì)胞因子，myostatin通

2、過結(jié)合其受體引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而開啟或關(guān)閉一系列基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室的前期工作研究表明，通過myostatin處理胚胎雞原代肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)雞鋅指蛋白c-RZF(chicken Ring Zinc Finger Protein)是myostatin的下游靶基因，并受myostatin的正調(diào)控，并且在雞原代細(xì)胞中過量表達(dá)c-RZF會(huì)抑制細(xì)胞增殖。
　　本實(shí)驗(yàn)中找到了c-RZF在人、小鼠、爪蟾和斑馬魚中的同源基因RNF(Ring Fi

3、nger Protein)，RNF在各物種之間具有很高的保守性。根據(jù)其氨基酸序列中含有指環(huán)結(jié)構(gòu)域的特征推測(cè)它可能為一種E3泛素連接酶(Ubiquitin-ligation enzyme，E3 ligase)。為鑒定RNF引導(dǎo)泛素化的作用底物及其相關(guān)的結(jié)合蛋白，利用酵母二元雜交的方法在成年人骨骼肌cDNA文庫(kù)中篩選得到了hRNF相互作用蛋白Ubiquilin1。以此為線索為進(jìn)一步以雞為模式生物研究myostatin靶基因c-RZF與Ubi

4、quilin1之間的相互作用，利用電子克隆和5’RACE的方法克隆了雞ubiquilin1基因。雞ubiquilin1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1761bp，編碼蛋白為586個(gè)氨基酸，與人Ubiquilin1蛋白氨基酸序列同源性達(dá)到了95％。為確認(rèn)c-RZF與cUbiquilin1之間的相互作用以及參與其相互作用的結(jié)構(gòu)域，表達(dá)并純化了GST-cUbiquilin1以及GST-cUbiquilin1(UBAΔ)融合蛋白，以進(jìn)行后續(xù)的Pull-down