家蠶BmFoxO靶基因的鑒定.pdf

1、衰老是所有生物體均需經(jīng)歷的多因子參與的復(fù)雜的生物學(xué)過程，伴隨著一系列衰老相關(guān)的疾病，如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、骨骼系統(tǒng)疾病和癌癥等的發(fā)生。衰老的進(jìn)程受到進(jìn)化上較為保守的信號(hào)通路所調(diào)控，這為延緩衰老和預(yù)防衰老相關(guān)疾病提供了可能。一些重要且保守的長壽信號(hào)通路，如胰島素信號(hào)通路、TOR、AMPK、Sirt均需要或部分需要通過重要的轉(zhuǎn)錄因子FoxO發(fā)揮其作用。FoxO是一個(gè)進(jìn)化上保守的壽命調(diào)節(jié)基因，在酵母、線蟲、果蠅與小鼠中

2、上調(diào)FoxO的表達(dá)量都能夠延長壽命。家蠶BmFoxO基因也能調(diào)控家蠶壽命。由于BmFoxO編碼的蛋白屬于轉(zhuǎn)錄因子，故而需要通過調(diào)控下游靶基因來實(shí)現(xiàn)生物學(xué)作用。因此，鑒定BmFoxO的靶基因，尋找下游影響衰老的基因就變得尤為重要。本研究主要基于表達(dá)譜測(cè)序鑒定BmFoxO的靶基因。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴將構(gòu)建成功的BmFoxO過表達(dá)和干涉載體轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞系，提取RNA進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序。BmFoxO過表達(dá)組與對(duì)照組比較，篩選得到

3、差異表達(dá)基因4144個(gè)，其中上調(diào)基因3624個(gè)、下調(diào)基因520個(gè)。BmFoxO干涉組與對(duì)照組比較，篩選得到差異表達(dá)基因4563個(gè)，其中上調(diào)基因4240個(gè)、下調(diào)基因323個(gè)。利用維恩圖將兩組基因集取交集后共篩選得到受BmFoxO正向或負(fù)向調(diào)控的靶基因212個(gè)。其中受BmFoxO正向調(diào)控的基因90個(gè)，負(fù)向調(diào)控的基因122個(gè)。這些差異表達(dá)基因共參與了54個(gè)信號(hào)通路，涉及代謝、蛋白穩(wěn)態(tài)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、衰老及衰老相關(guān)疾病等。根據(jù)BmFoxO特異性識(shí)別

4、的保守的結(jié)合基序（TTGTTTAC），對(duì)上述的212個(gè)基因的上游3K序列進(jìn)行篩查，得到43個(gè)潛在的BmFoxO直接靶基因。⑵經(jīng)熒光定量驗(yàn)證了BmFoxO能夠正向或負(fù)向調(diào)控 BGIBMGA002618、BGIBMGA000459、BGIBMGA012030、BGIBMGA009731、BGIBMGA005655的表達(dá)水平，過表達(dá)BmFoxO后，BGIBMGA012030的表達(dá)水平上調(diào)最為顯著，約為對(duì)照組的20倍。其次，截取靶基因上游含有T

5、TGTTTAC基序的調(diào)控序列，進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，BmFoxO能夠與靶基因上游調(diào)控序列結(jié)合，顯著激活熒光素酶活性。BmFoxO對(duì)BGIBMGA005655的上游序列的調(diào)控活性最高，約為對(duì)照組的30倍，進(jìn)一步對(duì)其上游調(diào)控序列進(jìn)行截短實(shí)驗(yàn)，通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，得到BmFoxO調(diào)控BGIBMGA005655上游核心序列位于上游0.8K。⑶利用生物信息學(xué)對(duì) BGIBMGA005655蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其為亮氨酸富集重復(fù)序列蛋白，具

6、有5個(gè)亮氨酸拉鏈（LRR）；系統(tǒng)發(fā)生分析表明，BGIBMGA005655在各物種中廣泛分布。家蠶幼蟲5齡3天幼蟲組織表達(dá)分析顯示，BGIBMGA005655在家蠶頭、表皮、中腸和后部絲腺高量表達(dá)。成功構(gòu)建了BGIBMGA005655細(xì)胞過表達(dá)載體 pIZ/V5-Red-5655和干涉載體pIZ/V5-Red-SiRNA5655。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，BGIBMGA005655表達(dá)的蛋白質(zhì)主要位于細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞中改變 BGIBMGA0056