宿主分子TXNIP影響HCV復(fù)制的分子機(jī)制研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV，hepatitis C virus)感染可影響宿主細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)、改變細(xì)胞基因的表達(dá)，宿主基因表達(dá)的變化可能影響病毒的感染或參與病毒的致病。本課題通過(guò)表達(dá)譜基因芯片分析，找出了一個(gè)在HCV感染后表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞分子:硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP，thioredoxin-interactingprotein)，并發(fā)現(xiàn)敲低Huh7細(xì)胞中TXNIP的表達(dá)會(huì)抑制J6/JFH1株HCVcc的感染。進(jìn)一步對(duì)TXNIP進(jìn)行深入研

2、究，驗(yàn)證其差異表達(dá)，探討其對(duì)HCV感染的影響:1、HCV通過(guò)什么機(jī)制誘導(dǎo)TXNIP上調(diào);2、TXNP在HCV的生命周期中發(fā)揮什么作用;3、HCV感染誘導(dǎo)的TXNIP上調(diào)是否參與到HCV的致病過(guò)程。希望通過(guò)研究，揭示宿主分子TXNIP與HCV相互作用的分子機(jī)制，探討TXNIP分子對(duì)HCV感染與致病的影響。
　　本文主要結(jié)果及結(jié)論如下:
　　（一）HCV感染誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞系表達(dá)譜變化，宿主分子TXNIP轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)
　　

3、利用MOI=1的HCVcc感染Huh7細(xì)胞，感染72 h以后用抽提感染細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，樣品送生物技術(shù)技術(shù)公司進(jìn)行Glue Grant Human TranscriptomeArray基因芯片分析，比較HCVcc感染前后的Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組差異。發(fā)現(xiàn)了871個(gè)顯著上調(diào)基因（上調(diào)≥1.5倍），765個(gè)下調(diào)基因（下調(diào)≤0.66倍）;2339個(gè)上調(diào)顯著的非編碼RNA，2479個(gè)下調(diào)顯著的非編碼RNA;27條變化顯著的miRNA，以

4、及210個(gè)可變剪切方式變化顯著的基因?？梢钥闯觯贖uh7細(xì)胞系感染HCVcc以后，宿主分子TXNIP的mRNA上調(diào)約3.7倍。采用RT-PCR法，對(duì)感染HCVcc和對(duì)照組的Huh7細(xì)胞中TXNIP的mRNA轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行驗(yàn)證，再一次確定了在HCVcc感染的Huh7細(xì)胞中TXNIP轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。為進(jìn)一步研究HCVcc感染后基因表達(dá)譜變化，對(duì)用MOI=1的HCVcc感染12h，36 h，60 h的Huh7細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度

5、測(cè)序，并將其與各時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照樣品進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明:TXNIP的mRNA在HCVcc感染后36h，60 h均有明顯上調(diào)，以36h上調(diào)最為顯著。
　?。ǘ└蓴_TXNIP表達(dá)會(huì)使HCV復(fù)制受到影響
　　合成針對(duì)TXNIP的siRNA，轉(zhuǎn)染Huh7或Huh7.5.1細(xì)胞以敲低TXNIP的表達(dá)。感染MOI=0.2的HCVcc，48 h后免疫熒光檢測(cè)HCVcc的感染。結(jié)果顯示，TXNIP敲低的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染非特異結(jié)合的siRNA陰性對(duì)照

6、組以及未轉(zhuǎn)染siRNA的空白對(duì)照組相比，HCVcc的感染量顯著降低。將構(gòu)建好的TXNIP真核表答載體轉(zhuǎn)染到Huh7和Huh7.5.1細(xì)胞中，陰性對(duì)照為轉(zhuǎn)染GFP真核表答載體的細(xì)胞，空白對(duì)照的細(xì)胞不進(jìn)行任何處理。隨后感染MOI=0.2的HCVcc，48 h后免疫熒光檢測(cè)HCVcc的感染。結(jié)果顯示，TXNIP過(guò)表答的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染GFP表達(dá)質(zhì)粒的陰性對(duì)照以及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對(duì)照細(xì)胞相比，HCVcc的感染有所提高。
　　為檢測(cè)宿主分子TXN

7、IP對(duì)HCV入侵的影響，將siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7.5.1細(xì)胞系中降低TXNIP表達(dá)，陰性對(duì)照為轉(zhuǎn)染非特異結(jié)合的siRNA，空白對(duì)照不做處理，分別感染HCV入侵模型:con1型的HCVpp。培養(yǎng)72 h后直接在熒光顯微鏡下觀察帶有綠色熒光標(biāo)記的HCVpp感染細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，敲低TXNIP的表達(dá)不影響HCVpp的入侵。
　　為檢測(cè)宿主分子TXNIP對(duì)HCV復(fù)制的影響。在1b基因型HCV亞基因組復(fù)制子BB7細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染siRN

8、A干擾TXNIP的表達(dá)，對(duì)照組轉(zhuǎn)染非特異結(jié)合的siRNA。轉(zhuǎn)染72 h后抽提BB7細(xì)胞系中RNA，采用RT-PCR檢測(cè)J6/JFH1型HCV非結(jié)構(gòu)基因的含量。結(jié)果顯示降低宿主分子TXNIP的表達(dá)，HCV的復(fù)制水平隨之明顯降低。
　　綜上所述，宿主細(xì)胞中的TXNIP對(duì)HCV的感染有促進(jìn)作用。這種促進(jìn)作用可能作用于HCV復(fù)制階段。
　　（三）HCV感染不會(huì)誘導(dǎo)Huh7.5.1細(xì)胞系中TXNIP上調(diào)
　　為驗(yàn)證HCVcc感染

9、誘導(dǎo)TXNIP上調(diào)的情況是否在其它可以感染HCV的細(xì)胞系中成立，在Huh7和Huh7.5.1中進(jìn)行了更細(xì)致的研究。其中Huh7.5.1和Huh7相比，RIG-1基因發(fā)生突變，因此在病毒RNA誘導(dǎo)的IFN合成方面具有缺陷。用MOI=0.5的HCVcc感染Huh7和Huh7.5.1細(xì)胞，分別取感染12h、以及1-4天的樣本以及相應(yīng)的對(duì)照樣本，用RT-PCR檢測(cè)TXNIP mRNA的變化情況。結(jié)果顯示，在Huh7細(xì)胞中，HCVcc感染1天以后

10、即可以檢測(cè)到TXNIP在mRNA水平和蛋白水平上的上調(diào)。而在Huh7.5.1細(xì)胞中，HCVcc感染并沒(méi)有使TXNIP的mRNA和蛋白表達(dá)量有所提高。
　?。ㄋ模└蓴_素誘導(dǎo)Huh7和Huh7.5.1細(xì)胞系中TXNIP上調(diào)
　　分別合成IFN-α、IFN-β以及IFN-λ的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收取細(xì)胞上清以及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)上清（對(duì)照）。用不同濃度的干擾素上清處理HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞，2天后免疫熒光