rhIL-15和rhIL-12分別促進(jìn)huPBL在NOD-SCID小鼠體內(nèi)重建及HBV疫苗的體內(nèi)免疫應(yīng)答.pdf

1、由于倫理道德等因素的限制，多種人類疾病的研究不能直接在人體進(jìn)行，需要依賴于體內(nèi)的動物實(shí)驗(yàn)。過去的幾十年，相繼有多種疾病模型被報道，并極大地推動了人類疾病的研究和藥物開發(fā)。由于人類和動物免疫系統(tǒng)存在明顯的遺傳方面的不同，建立帶有人類免疫系統(tǒng)的人鼠嵌合體將有助于在動物體內(nèi)研究人類基礎(chǔ)免疫和評價疫苗效果等應(yīng)用研究。近年來，陸續(xù)報道了幾種在小鼠體內(nèi)重建人類免疫系統(tǒng)的動物模型，如將人的胎兒胸腺、胎肝和胎骨甚至成人的外周血造血干細(xì)胞移植到患有嚴(yán)重聯(lián)

2、合免疫缺陷綜合征(severecombinedimmunodeficiencysyndrome，SCID)的小鼠體內(nèi)，分別構(gòu)建成SCIDhyTHy/Liv、SCIDhuBone、SCIDHuPBL等幾種人鼠嵌合小鼠模型。其中，人外周血淋巴細(xì)胞(HuPBL)，具有來源方便，重建后的動物模型中T、B淋巴細(xì)胞都具有功能，并可以檢測到人免疫球蛋白的存在的優(yōu)點(diǎn)，因而更廣受重視。 已經(jīng)報道的幾種人鼠嵌合小鼠模型各有千秋。早期的HuPBL-

3、SCID模型，人淋巴細(xì)胞重建效率低下(大約0.1％)，很難用這樣的模型分析抗原特異的細(xì)胞免疫或者體液免疫反應(yīng)，因而大大降低了該模型的廣泛應(yīng)用。針對上述缺陷，人們試圖增加淋巴細(xì)胞的輸入數(shù)量、或者轉(zhuǎn)輸之前給予小鼠亞致死量的放射線照射，甚至轉(zhuǎn)輸細(xì)胞前注射抗ASGM1以清除小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞的排斥反應(yīng)，來促進(jìn)淋巴細(xì)胞重建效率。后來不同的研究小組又嘗試使用人生長因子激素、IL-4或者IL-6作為刺激劑來改善重建效率，然而，這幾種改進(jìn)方法收效不是很明

4、顯，只能有限地促進(jìn)人T淋巴細(xì)胞在SCID小鼠體內(nèi)重建。因而，目前迫切需要一種改進(jìn)方法來完善淋巴細(xì)胞在SCID/NOD-SCID小鼠體內(nèi)重建，同時重建后的人淋巴細(xì)胞具有正常功能。本研究旨在通過應(yīng)用造血相關(guān)的細(xì)胞因子(rhIL-15)刺激造血前體細(xì)胞，促進(jìn)人PBL在NOD-SCID鼠體內(nèi)重建，主要試圖解決以下三個科學(xué)問題：建立新型HuPBL/NOD-SCID嵌合體模型，以推動該模型在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中的進(jìn)一步深入研究；深入了解rhIL-15在HuP

5、BL/NOD-SCID重建中的作用；應(yīng)用HuPBL/NOD-SCID嵌合模型進(jìn)一步研究rhIL-12在HBV疫苗免疫中的佐劑效應(yīng)。本研究獲得的主要結(jié)果大致分為以下五個部分：一、rhIL-15促進(jìn)HuPBL在NOD-SCID鼠體內(nèi)重建 白細(xì)胞介素15(IL-15)具有多種生物學(xué)功能，已經(jīng)被證明有促進(jìn)多種造血能力，它可以促進(jìn)NK細(xì)胞的分化、發(fā)育，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增；B細(xì)胞的發(fā)育、成熟等。這些結(jié)果表明IL-15是一種很強(qiáng)的促進(jìn)造血

6、干細(xì)胞分化、發(fā)育的細(xì)胞因子，它可能適合作為huPBL轉(zhuǎn)輸NOD-SCID小鼠后免疫重建的促進(jìn)劑。我們采用HIV、HBV均為陰性的正常獻(xiàn)血員血液，用密度梯度離心法(Ficolldensitygradientcentrifugation)分離外周血淋巴細(xì)胞，在轉(zhuǎn)輸前12-36小時，給NOD-SCID小鼠注射40-60μL抗ASGM1(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.Japan)，同時在轉(zhuǎn)輸前2-4小時，對NOD

7、-SCID鼠用200cGy放射線進(jìn)行照射。每只鼠腹腔注射5×107個HuPBL，細(xì)胞轉(zhuǎn)輸后第二天，受體鼠腹腔注射rhIL-151μg/只，然后每隔一天腹腔注射rhIL-151次，劑量相同，共計注射10次。通過實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)如果rhIL-15使用劑量過大(10μg/只)，會引起移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生，小鼠會發(fā)生消瘦、皮膚損傷、甚至死亡，而使用劑量過低，沒有很好的促進(jìn)效果，最后選擇的合適劑量為1μg/只鼠。我們用FACS技術(shù)檢測了

8、嵌合體小鼠淋巴器官中人淋巴細(xì)胞的重建情況，發(fā)現(xiàn)使用rhIL-15重建的小鼠比沒有使用的小鼠，淋巴器官中人T淋巴細(xì)胞增加了11-80倍，而對B細(xì)胞、NK細(xì)胞的影響不明顯。我們采用定量ELISA檢測HuPBL/NOD-SCID嵌合鼠血清中人免疫球蛋白IgG、IgM的水平，發(fā)現(xiàn)rhIL-15可以明顯提高免疫球蛋白的產(chǎn)生。上述實(shí)驗(yàn)說明rhIL-15可以促進(jìn)人T淋巴細(xì)胞在NOD-SCID小鼠體內(nèi)重建，且和使用的劑量有關(guān)。 二、rhIL-

9、15促進(jìn)人PBL從NOD-SCID小鼠的腹腔向淋巴器官定向轉(zhuǎn)移 為了搞清rhIL-15促進(jìn)人PBL在NOD-SCID中重建的機(jī)制，我們觀測了不同時間點(diǎn)：第7、第14、第21、第28天，HuPBL/NOD-SCID腹腔、胸腺和脾臟內(nèi)人T淋巴的數(shù)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，rhIL-15免疫的HuPBL/NOD-SCID小鼠腹腔中人T淋巴細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，而與之相對應(yīng)的是，嵌合體小鼠的胸腺和脾臟等淋巴器官內(nèi)人T淋巴細(xì)胞的數(shù)量

10、卻在不斷增加，我們同時還檢測了嵌合體鼠的非淋巴器官肺臟和小腸，沒有發(fā)現(xiàn)人淋巴細(xì)胞的存在。這說明rhIL-15可以促進(jìn)人T淋巴細(xì)胞從小鼠的腹腔向淋巴器官定向轉(zhuǎn)移。 三、rhIL-15免疫的HuPBL/NOD-SCID小鼠體內(nèi)的人T淋巴細(xì)胞具有功能 考慮人鼠嵌合模型是否建立成功除了要看人的淋巴細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的分布和表型以外，還要檢測轉(zhuǎn)輸后的細(xì)胞功能是否正常。我們?nèi)L-15免疫的HuPBL/NOD-SCID小鼠的淋巴結(jié)細(xì)

11、胞，在體外用PHA刺激，檢測細(xì)胞的增值效應(yīng)。我們知道由于NOD-SCID小鼠體內(nèi)沒有T淋巴細(xì)胞的存在，而PHA又是T細(xì)胞的特異性促增值劑，如果實(shí)驗(yàn)中發(fā)生了細(xì)胞的增值，那一定是轉(zhuǎn)輸成功的人T細(xì)胞的擴(kuò)增使然。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明IL-15處理的嵌合體小鼠，人T淋巴細(xì)胞在PHA刺激后的增值水平和正常供者的外周血T淋巴細(xì)胞沒有什么明顯差別。同時用定量ELISA方法測定細(xì)胞增值時的上清中IFN-γ、IL-2的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和正常對照外周血T細(xì)胞相比也沒有

12、多大差異。這些結(jié)果說明重建后的人T淋巴細(xì)胞具有正常的功能。 四、rhIL-12促進(jìn)HBsAg疫苗的免疫效果 已知預(yù)防乙型肝炎最好的方法式是乙肝疫苗，然而乙肝疫苗的免疫預(yù)防的效果并不十分完美。有些人預(yù)防接種該疫苗后不能產(chǎn)生有效的抗乙肝的特異性抗體。對于這部分人來說，注射目前的乙肝預(yù)防疫苗對防止乙型肝炎感染沒有多少意義。我們考慮尋找一種額外的佐劑來促進(jìn)乙肝疫苗在人體中的免疫效果。目前IL-12作為細(xì)胞免疫的佐劑在動物體內(nèi)

13、已有報道，由于在臨床研究中還不能開展，為了滿足進(jìn)一步的研究需要，我們在實(shí)驗(yàn)中引入了人鼠嵌合體模型。我們把人外周血PBL細(xì)胞在體外預(yù)先刺激后直接接種在NOD-SCID鼠脾臟內(nèi)，然后用IL-12聯(lián)合乙肝疫苗免疫嵌合體鼠。我們用定量ELISA技術(shù)檢測了小鼠體內(nèi)抗HBsAg特異性抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IL-12明顯提高了嵌合模型小鼠外周血中特異性抗HBsAgIgG、IgM的水平，進(jìn)一步檢測IgG的亞型發(fā)現(xiàn)，IL-12大大提高了小鼠血清中抗乙肝IgG2

14、a抗體的水平，而特異性IgG1抗體產(chǎn)生還有一定程度的減少。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明IL-12可以作為HBsAg疫苗的有效佐劑使用。 五、rhIL-12調(diào)節(jié)HuPBL/NOD-SCID嵌合鼠中人CD4+Th細(xì)胞向Th1狀態(tài)的改變?yōu)榱诉M(jìn)一步了解IL-12聯(lián)合HBsAg疫苗免疫后HuPBL/NOD-SCID體內(nèi)細(xì)胞的狀態(tài)變化，我們?nèi)∏逗象w小鼠的淋巴細(xì)胞在體外用HBsAg抗原刺激，同時用FACS檢測刺激后細(xì)胞變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引起增值的主要是人

15、CD4+Th細(xì)胞，而CD8+Th細(xì)胞和B細(xì)胞變化不太明顯。與其同時我們還檢測了細(xì)胞的培養(yǎng)上清中產(chǎn)生的細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10)的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhIL-12聯(lián)合免疫的嵌合體小鼠分泌的細(xì)胞因子以Th1型為主(IFN-γ，IL-2)，而Th2型細(xì)胞因子的分泌卻有所下降(IL-4，IL-10)。這些結(jié)果表明rhIL-12加強(qiáng)了小鼠體內(nèi)Th1狀態(tài)，抑制了Th2狀態(tài)。 綜上所述，rhIL-15可以有效促進(jìn)人T