組織工程技術(shù)移植雪旺細(xì)胞治療脊髓損傷的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代工業(yè)、交通運(yùn)輸業(yè)和建筑業(yè)的發(fā)展，脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)的發(fā)生率也呈逐年上升的趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，美國(guó)每年約有1萬(wàn)例新的脊髓損傷患者，我國(guó)上海脊髓損傷的年發(fā)生率約為13.7/100萬(wàn)。當(dāng)今脊髓損傷在全球呈：高致殘率(全癱為67％)、高耗費(fèi)(5-7萬(wàn)美元/患者/年，美國(guó))、低死亡率(<5％)、患者主要為青壯年(70％患者<40歲)等特點(diǎn)，給社會(huì)帶來(lái)巨大的損失和沉重的負(fù)擔(dān)，已成為全球性的醫(yī)療難題。目前臨床上

2、對(duì)脊髓損傷的治療主要著手于防治脊髓損傷后脊髓繼發(fā)性損害、保護(hù)殘存神經(jīng)元功能，方法有早期大劑量甲基強(qiáng)的松龍沖擊療法、外科干預(yù)及康復(fù)訓(xùn)練等，而這些方法對(duì)軸突連續(xù)性中斷導(dǎo)致的神經(jīng)元靶源性營(yíng)養(yǎng)供給減少和生理電信號(hào)及化學(xué)傳遞功能受損的作用微乎其微，因而預(yù)后仍然很差。這是由于脊髓損傷后脊髓神經(jīng)元再生功能差，損傷區(qū)域與正常組織之間有星形膠質(zhì)細(xì)胞增生形成膠質(zhì)瘢痕作為物理屏障及受損神經(jīng)元軸突缺少神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的刺激而無(wú)延長(zhǎng)能力作為化學(xué)屏障等因素有關(guān)。因此，

3、促進(jìn)脊髓再生、克服再生屏障是目前國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)及熱點(diǎn)。本項(xiàng)目旨在探索利用組織工程技術(shù)進(jìn)行自體雪旺氏細(xì)胞移植的方法治療脊髓損傷，使脊髓損傷后神經(jīng)纖維再生、傳導(dǎo)功能恢復(fù)，為脊髓損傷的治療作進(jìn)一步基礎(chǔ)及臨床研究提供理論基礎(chǔ)。 近20年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究已證明，成年神經(jīng)元具有再生的潛能，損傷的脊髓神經(jīng)元在適宜的條件下可以再生。在促進(jìn)軸突再生的基礎(chǔ)研究中，通過(guò)多種技術(shù)如細(xì)胞移植、基因治療、細(xì)胞內(nèi)分子信號(hào)的修飾和克服再生屏障等研究，證實(shí)成年哺乳

4、動(dòng)物的中樞神經(jīng)元在受損后確實(shí)可以再生，甚至產(chǎn)生靶支配。但脊髓損傷后解剖重建和功能恢復(fù)是十分棘手的問(wèn)題，當(dāng)前對(duì)脊髓損傷后修復(fù)研究的主要途徑是從促進(jìn)神經(jīng)元軸突的再生和組織移植替代兩個(gè)方面來(lái)探討脊髓修復(fù)及功能恢復(fù)的可行性。于是，雪旺細(xì)胞移植治療脊髓損傷成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 現(xiàn)已證實(shí)雪旺氏細(xì)胞分泌的神經(jīng)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)神經(jīng)再生具有重要作用。過(guò)去十余年，神經(jīng)科學(xué)工作者對(duì)雪旺細(xì)胞移植治療脊髓損傷進(jìn)行了初步的探索，并證實(shí)雪旺氏細(xì)

5、胞移植可以促進(jìn)脊髓損傷近端神經(jīng)元軸突向遠(yuǎn)端延伸、損傷神經(jīng)元髓鞘化。但關(guān)于雪旺氏細(xì)胞的活化、移植方式及移植介質(zhì)仍在探索之中。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者重點(diǎn)從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究：對(duì)雪旺氏細(xì)胞進(jìn)行基因修飾使之分泌大量神經(jīng)生長(zhǎng)因子以誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元的再生；神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因修飾后的雪旺氏細(xì)胞與膠原母細(xì)胞按一定比例(5∶1)培養(yǎng)于膠原基質(zhì)中，再植入脊髓損傷處，誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元再生；將聚乳酸支架制成筒狀直接包繞雪旺氏細(xì)胞植入脊髓損傷處從而治療脊髓損傷。同時(shí)，學(xué)者們

6、對(duì)各種脊髓損傷模型也進(jìn)行了探討，包括挫傷、不完全損傷、橫斷損傷等。各種實(shí)驗(yàn)在解剖重建和電生理檢測(cè)方面都得到滿意的結(jié)果，但運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)卻未見報(bào)告。組織工程技術(shù)是一門新興的醫(yī)學(xué)技術(shù)，在各個(gè)領(lǐng)域已顯出巨大的應(yīng)用前景。早在1995年就有研究人員應(yīng)用組織工程技術(shù)移植雪旺細(xì)胞治療脊髓損傷了，在神經(jīng)纖維再生方面獲得了可喜的成績(jī)，但由于支架材料選擇上的欠缺，并未有突破性的研究成果。本研究擬在脊髓損傷的組織工程技術(shù)方面進(jìn)行進(jìn)一步的探索?，F(xiàn)已證實(shí)在脊髓橫斷

7、損傷處移植雪旺氏細(xì)胞后，在移植體與脊髓斷端接觸面之間并無(wú)明顯的炎癥反應(yīng)，且脊髓兩斷端之間有有髓神經(jīng)纖維生長(zhǎng)。因此本研究的基本思路是：取外周神經(jīng)分離、純化雪旺氏細(xì)胞，進(jìn)行人類NGF(Nerve Growth Factor)基因轉(zhuǎn)染，使能夠穩(wěn)定高效表達(dá)NGF，然后將其注入膠原制成的海棉狀可吸收生物支架上，一起植入脊髓離斷傷處，觀察脊髓神經(jīng)元再生及脊髓傳導(dǎo)功能恢復(fù)的情況。從而評(píng)價(jià)應(yīng)用組織工程技術(shù)進(jìn)行雪旺細(xì)胞移植在脊髓橫斷性損傷中的治療作用，為

8、脊髓損傷后的治療作進(jìn)一步基礎(chǔ)及臨床研究提供理論基礎(chǔ)。 在本研究的第一部分，我們應(yīng)用植塊法與消化法相結(jié)合的方法進(jìn)行原代雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)。以新生SD大鼠的雙側(cè)坐骨神經(jīng)為材，剝?nèi)ド窠?jīng)外膜，剪成1mm大小的碎塊，用0.25％的胰蛋白酶和0.03％膠原酶消化12分鐘，然后種植培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM，24小時(shí)后用阿糖胞苷去除成纖維細(xì)胞，共24小時(shí)，以后每2-3天更換培養(yǎng)液。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的2-6天細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，12天后細(xì)胞

9、生長(zhǎng)達(dá)到高峰。經(jīng)S-100熒光染色鑒定雪旺細(xì)胞，結(jié)合Hoechst核染色后可算出原代細(xì)胞純度達(dá)95.1％，傳一代后細(xì)胞純度更達(dá)96.3％，10個(gè)新生鼠經(jīng)過(guò)原代培養(yǎng)12天后可以獲得大約3.0×10<'6>的雪旺細(xì)胞。同時(shí)發(fā)現(xiàn)本方法所培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞在28天后才開始凋亡，完全能滿足組織工程應(yīng)用的要求。 本研究的第二部分中，由Genebank中查得hNGF-β片段的序列，合成引物后成功構(gòu)建了hNGF-β基因片段，與Genebank中相符

10、合。接著進(jìn)行慢病毒載體Lenfivirus的包裝。以Qiagen公司的提取慢病毒包裝系統(tǒng)由pGC-E1載體，pHelper 1.0(gag/pol元件)載體，Helper 2.0(VSV6元件)載體三質(zhì)粒組成，其中pgC-E1載體含有CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白 GFP?？捎糜诓《景b時(shí)轉(zhuǎn)染效率，以及感染宿主細(xì)胞的感染效率的檢測(cè)。將6FP蛋白替換為其他外源基因，或者一同插入外源基因，既可以表達(dá)目的基因，又有熒光蛋白檢測(cè)。Helper 1.

11、0質(zhì)粒中含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。pHelper 2.0質(zhì)粒中含有單純皰疹病毒來(lái)源的VSVg基因，提供病毒包裝所需要的衣殼蛋白。以293T細(xì)胞為包裝細(xì)胞，在病毒攜帶的綠色熒光蛋白的幫助下，很方便的能夠觀察到重組慢病毒 Lentivirus-hNGFβ的產(chǎn)生。應(yīng)用本方法成功地獲得了高滴度的單一重組病毒(2×10<'8>TU/ml

12、)。 在第三部分的研究中，我們?cè)谇皟刹糠值幕A(chǔ)上在體外檢測(cè)了所構(gòu)建的重組慢病毒載體Lentivirus-hNGF β對(duì)雪旺細(xì)胞的感染效率。分別以MOI值為1、5、10、20、40對(duì)雪旺細(xì)胞進(jìn)行感染，結(jié)果顯示當(dāng)MOI值為10時(shí)感染效率最高，可達(dá)90％。GFP在雪旺細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)在感染7天達(dá)到高峰。經(jīng)RT-PCR證實(shí)有hNOF mRNA的表達(dá)，以山羊抗hNGF抗體行western Blot實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了NGF的表達(dá)，從而為下一步的體內(nèi)實(shí)

13、驗(yàn)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 在前面三部分研究的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了第四部分的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。以雌性SD成鼠為動(dòng)物模型，在T8-9平面離斷脊髓約3cm，以膠原海棉為生物支架植入脊髓離斷處，然后將基因修飾的雪旺細(xì)胞懸液注入支架上，每個(gè)老鼠的細(xì)胞植入量約為2×10<'6>。在移植后1周、1個(gè)月、2個(gè)月的3個(gè)時(shí)間段分別取材觀察細(xì)胞的存活情況、NGF的表達(dá)以及支架吸收情況。經(jīng)熒光顯微鏡觀察顯示，雪旺細(xì)胞在體內(nèi)的支架上2個(gè)月后仍存活良好，經(jīng)電鏡觀察亦

14、證實(shí)了雪旺細(xì)胞的存活。經(jīng)免疫組化及Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到NGF得到了良好的表達(dá)，初步說(shuō)明了該組織工程技術(shù)治療脊髓損傷的可行性。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)我們成功地在體外培養(yǎng)了原代雪旺細(xì)胞，并了解了雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律；成功地構(gòu)建了慢病毒 Lentivirus-hNGF 基因載體并在體外檢測(cè)了Lentivirus-hNGF對(duì)雪旺細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。將hNGF基因修飾的雪旺細(xì)胞與膠原海棉可吸收生物支架一起植入脊髓離斷傷處，雪旺細(xì)胞與膠原海