胞外HMGB1通過(guò)SDF-1-CXCR-4軸對(duì)臍血CD34+細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:探索HMGB1(高遷移率族蛋白B1)和/或SDF-1(CXCL12,基質(zhì)細(xì)胞衍化因子)對(duì)臍血CD34+細(xì)胞的遷移、阻斷、粘附、克隆形成作用,并探討HMGB1是否通過(guò)SDF-1/CXCR-4軸促進(jìn)臍血CD34+細(xì)胞的趨化作用。
　　方法:采集正常足月順產(chǎn)新生兒臍血標(biāo)本,羥乙基淀粉沉淀紅細(xì)胞,通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液得到臍血單個(gè)核細(xì)胞,顯微鏡(5×)下計(jì)數(shù)單個(gè)核細(xì)胞數(shù),使用CD34+免疫磁珠分選得到CD34+細(xì)胞,運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)

2、CD34+細(xì)胞的純度。利用Transwell小室觀察細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),其中上孔添加含1*105/孔細(xì)胞液。利用不同濃度HMGB1和/或SDF-1(0,10,25,50,100,200ng/ml)檢測(cè)HMGB1和/或SDF-1介導(dǎo)臍血CD34+細(xì)胞遷移作用的最佳濃度。臍血CD34+細(xì)胞表達(dá)CXCR-4(SDF-1受體)與HMGB1受體RAGE。我們使用抗-SDF-1、抗CXCR-4、抗-RAGE抗體檢測(cè)HMGB1單獨(dú)或與SDF-1聯(lián)合對(duì)臍血CD

3、34+細(xì)胞遷移作用,進(jìn)一步探討哪種受體是HMGB1和/或SDF-1遷移作用所必須的。將新鮮分選的CD34+細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)要求加至已經(jīng)包被的96孔板中,同時(shí)按照分組情況將細(xì)胞因子SDF-1及HMGB1加至相應(yīng)孔,經(jīng)孵育、洗滌、再孵育、離心后,通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)各個(gè)組的吸光度值。將0.9％甲基纖維素半固體培養(yǎng)基CFC加至24孔板中,每孔3ml,將CD34+細(xì)胞液(細(xì)胞數(shù)為1.0×105/孔)加入各組,每組300ul,5%CO2、37℃、飽和濕度的

4、孵箱中培養(yǎng)14d后,電子顯微鏡下(10×10)分別計(jì)數(shù)各組混合集落的生成,取平均值。
　　結(jié)果:1)磁珠分選的臍血單個(gè)核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞純度為95%以上,臍血CD34+細(xì)胞大量表達(dá)受體CXCR-4,同時(shí)正常人外周血也表達(dá)CXCR-4受體。2)25ng/ml的SDF-1不介導(dǎo)臍血CD34+細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng),而其最佳趨化濃度為100ng/ml,100ng/ml系HMGB1單獨(dú)作用的適宜濃度。通過(guò)劑量實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)100ng/mlHM

5、GB1聯(lián)合50ng/mlSDF-1可以更好的發(fā)揮協(xié)同作用（P<0.05)。3)阻斷實(shí)驗(yàn)中抗SDF-1(4ug/ml)和抗-CXCR-4(5ug/ml)抗體可減弱HMGB1獨(dú)自或聯(lián)合SDF-1介導(dǎo)的趨化運(yùn)動(dòng)。同時(shí)抗-RAGE抗體可以明顯減弱HMGB1的單獨(dú)趨化作用,但是抗-RAGE抗體對(duì)SDF-1聯(lián)合HMGB1介導(dǎo)的臍血CD34+細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)沒(méi)有顯著影響。4)粘附實(shí)中,與對(duì)照組相比,細(xì)胞因子SDF-1及HMGB1組均可以增加CD34+細(xì)胞

6、的吸光值,但兩種細(xì)胞因子的聯(lián)合作用并沒(méi)有較它們分別作用時(shí)有所提高(P>0.05)。5)與對(duì)照組相比,SDF-1組與HMGB1組均提高了CD34+細(xì)胞克隆數(shù),同時(shí)SDF-1聯(lián)合HMGB1組相對(duì)于它們分別作用時(shí)均明顯提高了細(xì)胞克隆數(shù)(P<0.05)。
　　結(jié)論:1)CD34+細(xì)胞大量表達(dá)CXCR-4受體,同時(shí)人外周血也表達(dá)CXCR-4受體。2)趨化實(shí)驗(yàn)說(shuō)明細(xì)胞因子SDF-1及HMGB1在濃度小于100ng/ml時(shí),它們對(duì)細(xì)胞的趨化作用

7、與濃度呈正相關(guān),但在濃度進(jìn)一步增加后,趨化作用不再增加。它們的最佳濃度均為100ng/ml,同時(shí)濃度為100ng/ml的HMGB1可以促進(jìn)50ng/mlSDF-1的趨化遷移能力。3)阻斷實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞因子HMGB1的遷移作用依賴于SDF-1/CXCR-4軸;受體RAGE參與部分遷移作用,但不起決定作用。4)粘附實(shí)驗(yàn)說(shuō)明細(xì)胞因子SDF-1及HMGB1均可以加強(qiáng)干細(xì)胞的粘附作用,但它們的聯(lián)合作用并不增加總體的粘附作用。5)克隆形成實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞