小膠質(zhì)細(xì)胞激活對皮質(zhì)神經(jīng)元SOD活性和MDA含量的影響.pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury，DAI)是在特殊外力作用下發(fā)生的以神經(jīng)元軸索腫脹、斷裂為主要特征的彌漫性腦損傷，可單獨(dú)出現(xiàn)也可伴隨其他病理改變，是導(dǎo)致顱腦損傷患者死亡、重殘和植物狀態(tài)生存的最常見原因之一。典型表現(xiàn)為意識障礙，且預(yù)后較差。研究表明，DAI后腦功能障礙不僅是由于最初的機(jī)械外力等作用所致的原發(fā)性損傷，很大程度上與損傷后發(fā)生的復(fù)雜的神經(jīng)元“二次打擊”(神經(jīng)元繼發(fā)性損傷)有關(guān)，其繼發(fā)性損傷是指損傷

2、后一系列生化和細(xì)胞反應(yīng)導(dǎo)致的延遲性軸索斷裂。
　　前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)觀察到DAI后，在β-APP陽性表達(dá)的軸索周圍有大量的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活。已有研究表明，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可出現(xiàn)“呼吸爆發(fā)現(xiàn)象”，產(chǎn)生數(shù)量驚人的自由基，引起脂質(zhì)過氧化，還可引起細(xì)胞成分脂質(zhì)、蛋白之間相互交聯(lián)，損傷神經(jīng)元功能。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)作為存在于胞漿和線粒體中的一種金屬蛋白酶，其活性高低可間接反映組織自由基的含量和脂質(zhì)過氧

3、化程度。丙二醛(malondialdehyde，MDA)作為細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸受到活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)攻擊后發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，其含量變化可間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。因此，神經(jīng)損傷的機(jī)制不僅限于直接的細(xì)胞因子作用，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生的毒性作用或許更為重要。然而在體外培養(yǎng)條件下小膠質(zhì)細(xì)胞是否可通過介導(dǎo)氧化損傷途徑參與皮質(zhì)神經(jīng)元的遲發(fā)性進(jìn)行性損傷尚未見報(bào)道。
　　

4、本實(shí)驗(yàn)采用乳鼠大腦皮質(zhì)原代培養(yǎng)，首先給予一定量Aβ1-40誘導(dǎo)激活小膠質(zhì)細(xì)胞，再用其條件培養(yǎng)基刺激皮質(zhì)神經(jīng)元。通過SOD活性和MDA含量變化系統(tǒng)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞是否對皮質(zhì)神經(jīng)元造成氧化損傷，以此探討在體外實(shí)驗(yàn)中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞與皮質(zhì)神經(jīng)元之間的相互作用。
　　方法：原代培養(yǎng)新生SD乳鼠(24h內(nèi))大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞。用不同濃度的可溶性Aβ1-40誘導(dǎo)激活小膠質(zhì)細(xì)胞后，采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中TNFα和IL-1β的分泌量以確定小

5、膠質(zhì)細(xì)胞最佳活化狀態(tài)。加入米諾環(huán)素后用Real Time PCR法和ELISA法檢測TNFα和IL-1β的表達(dá)變化，觀察其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用。再用活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基刺激原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元，隨機(jī)分為4組：對照組、1/2 Aβ-MCM組、1/4 Aβ-MCM組、1/8 Aβ-MCM組。每組包括5個(gè)時(shí)間點(diǎn)：1h、3h、6h、12h、24h。黃嘌呤氧化酶法測定各組皮質(zhì)神經(jīng)元超氧化物歧化酶(SOD)活力高低，硫代巴比妥酸法測定丙

6、二醛(MDA)含量變化，以此觀察神經(jīng)元的氧化損傷程度。
　　數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference，LSD)作兩兩比較。P＜0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1、Aβ1-40對小膠質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)激活及米諾環(huán)素的抑制作用：
　　ELISA法結(jié)果

7、顯示，1μMAβ1-40孵育6h能成功誘導(dǎo)激活小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNFα、IL-1β，與對照組相比有顯著性差異(p＜0.01)，并且這種誘導(dǎo)激活作用具有時(shí)間及濃度依賴性。加入0.2μM米諾環(huán)素后Real TimePCR法和ELISA法檢測結(jié)果均表明，米諾環(huán)素可明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞TNFα和IL-1β的分泌，MC+Aβ組與Aβ組相比明顯下降(p＜0.01)，與對照組相比無顯著性差異(p＞0.05)。因此我們選用終濃度為1μM的Aβ1-40孵育小

8、膠質(zhì)細(xì)胞6 h后的培養(yǎng)上清作為最佳條件培養(yǎng)基刺激皮質(zhì)神經(jīng)元。
　　2、小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基對皮質(zhì)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷：
　　結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度條件培養(yǎng)基刺激后，皮質(zhì)神經(jīng)元SOD活力值均低于對照組，以1/2 Aβ-MCM組最明顯，24h達(dá)到最低，與對照組相比，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且有隨刺激時(shí)間延長及刺激因子含量增加而漸低的趨勢，而1/4 Aβ-MCM組和1/8 Aβ-MCM組各時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)神經(jīng)元SOD活力值與對