血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大經典瞬時電位通道的表達改變及其對缺氧昨氧損傷的影響.pdf

1、目的：
　　 觀察血管緊張素(Angiotensin，Ang)Ⅱ誘導的肥大心肌細胞經典瞬時受體電位(Canonical Transient Receptor Potential，TRPC)通道表達變化以及其對細胞缺氧復氧損傷的影響。探討經典瞬時受體電位通道表達的分子機制和其在缺氧復氧誘導凋亡中的作用。
　　 方法：
　　 1.分離、培養(yǎng)健康新生Spraque-Dawley大鼠(2-5日齡)的心肌細胞
　　

2、 2.終濃度為0.1μ M血管緊張素Ⅱ刺激前述細胞48小時，誘導心肌細胞肥大。
　　 3.心肌肥大的鑒定：用BCA法測定細胞蛋白濃度，[3H]-亮氨酸摻入法檢測心肌細胞蛋白質合成速率，應用Motic Images1.3軟件測量心肌細胞的表面積。
　　 4.實驗分成7組：它們是對照組，AngⅡ組，SKF96365+AngⅡ組，Losartan+AngⅡ組，PD123319+AngⅡ組，U73122+AngⅡ組及CsA+An

3、gⅡ組。
　　 5.樣本進行細胞缺氧(5％CO2+95％N2)6小時，然后復氧(5％CO2+21％O2)4小時培養(yǎng)來模擬心肌的缺血再灌注。
　　 6.采用實時定量PCR技術檢測心肌細胞經典瞬耐受體電位通道TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6和TRPC7 mRNA的表達。
　　 7.采用蛋白雜交印跡技術，檢測細胞經典瞬時受體電位通道TRPC1、TRPC3和TRPC6以及肌細胞結構蛋

4、白α-fodrin的表達。
　　 8.采用Annexin V FITC/PI雙染色進行流式細胞檢測和Hoechst33258染色技術測定細胞凋亡率。
　　 結果：
　　 1.終濃度為0.1μ M血管緊張素Ⅱ成功誘導出肥大心肌細胞。與對照組相比，血管緊張素Ⅱ刺激心肌細胞48h后，[3H]-亮氨酸摻入明顯增加，(分別為2103±203 CPM/孔，n=6；1239±154 CPM/孔，n=6；p<0.05)。血管緊張

5、素Ⅱ組的蛋白濃度高于空白對照組(分別為1503±146μg/well，n=6；1075±118μ g/well，n=6；p<0.05)。MoticImages1.3軟件測量發(fā)現血管緊張素Ⅱ組細胞的表面積增加1.46倍。
　　 2.血管緊張素Ⅱ刺激心肌細胞48小時后，定量RT-PCR檢測TPRC的mRNA發(fā)現：TRPC1和TRPC3的mRNA表達上調，mRNA的量分別是空白對照組的1.45倍和1.24倍(p<0.05，n=4)；T

6、RPC6的mRNA未發(fā)現有明顯變化，(p>0.05，n=4)；而TRPC2、TRPC4、TRPC5以及TRPC7的mRNA低于對照組(p<0.05。n=4)。
　　 3.運用蛋白雜交印跡技術發(fā)現，在AngⅡ組TRPC1對GAPDH的相對密度比要高于對照組，而在AngⅡ組中TRPC3與TRPC6對GAPDH的相對密度比無明顯變化。表明血管緊張素Ⅱ在蛋白水平上調TRPC1表達，但未影響TRPC3和TRPC6表達。
　　 4.

7、加入血管緊張素Ⅱ前，分別先加入AT1受體阻滯劑Losartan、AT2受體阻滯劑PD123319、磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)抑制劑U73122、TRPC通道阻滯劑SKF96365和鈣調神經磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A(Cyclosporin A，CsA)。蛋白雜交印跡技術檢測發(fā)現，Losartan+AngⅡ組的TRPC1低于AngⅡ組與對照組，這在U73122+AngⅡ組，SKF96365+AngⅡ組和CsA+AngⅡ組

8、也呈現同樣的結果。但PD123319+AngⅡ組是個例外。這表明Losartan，U73122，SKF96365和CsA都能抑制血管緊張素Ⅱ刺激的心肌細胞TRPC1的高表達。而AT2受體阻滯劑PD123319對血管緊張素Ⅱ刺激的TRPC1高表達無明顯影響。
　　 5.[3H]-亮氨酸摻入法檢測發(fā)現，SKF96365+AngⅡ組的放射性強度(1452±172CPM/well)小于AngⅡ組放射性強度(2103±203 CPM/we

9、ll)(n=6；p<0.05)。同時發(fā)現SKF96365+AngⅡ組的細胞表面積小于AngⅡ組，是空白對照組的1.29倍，而AngⅡ組的細胞表面積是對照組的1.46倍，兩者相比有明顯差異(p<0.05)。表明SKF96365能部分抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。
　　 6.心肌細胞缺氧6小時后再復氧4小時進行缺氧復氧損傷檢測。(1)對照組，AngⅡ組與SKF96365+AngⅡ組的乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogen

10、ase，LDH)值和壞死率無顯著差異(p>0.05)。(2)Annexin V FITC/PI雙染色檢測和Hoechst33258染色檢測凋亡率，發(fā)現在AngⅡ組中凋亡率最高，SKF96365+AngⅡ組的凋亡率低于AngⅡ組。這表明SKF96365能降低凋亡率。(3)剪切α-fodrin蛋白與完整α-fodrin蛋白的比值在SKF96365+AngⅡ組高于對照組而低于AngⅡ組。
　　 結論
　　 1.體外培養(yǎng)新生大鼠

11、心肌細胞時，0.1μ M濃度的血管緊張素Ⅱ可安全成功地誘導出心肌細胞肥大。
　　 2.血管緊張素Ⅱ誘導的肥大心肌細胞中，其TRPC1的mRNA和蛋白表達上調；阻滯TRPC可以部分抑制血管緊張素Ⅱ誘導的細胞肥大，TRPC1在心肌肥大過程中發(fā)揮十分重要的作用。
　　 3.血管緊張素Ⅱ誘導TRPC1通道高表達的機制可能為：結合AT1受體-PLC-鈣調神經磷酸酶-活化T細胞核因子這一途徑來上調TRPC1表達，并通過TRPC1自身