油菜脂?！狝CP硫酯酶基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、油料作物種子的油脂是人類重要的營養(yǎng)和工業(yè)原料，有效提高其含油量和調控油脂成分成為提升油料作物生產(chǎn)效益的重要課題。因此，從油料作物中克隆、分析和鑒定硫酯酶基因(Fat)對于人工調控其含油量和油脂成分的研究具有重要意義。本論文主要通過從油菜種子中克隆植物酯酰?；d體蛋白硫酯酶基因BnFatB，分析和鑒定了其生物學功能，從而為改造油菜脂肪酸方面提供了重要的理論依據(jù)。
　　 植物脂酰一?；d體蛋白硫酯酶(Fat)是一種終止脂肪酸合成的酶

2、。它的基本功能就是將acyl-ACPs水解成游離脂肪酸和ACP，從而可達到終止脂肪酸從頭合成途徑中脂肪酸鏈延長過程的效果。植物中，不同的Fat具有其不同的底物特異性，直接決定了植物代謝過程中細胞油脂中脂肪酸的成分種類與數(shù)量。在不同植物物種及其組織中對于每種脂肪酸的需求量各不相同，因此at在植物細胞油脂代謝中就有著極其重要的作用。
　　 本研究根據(jù)擬南芥AtFatB(GenBank:NM100724.2)基因序列利用同源序列克隆法

3、從油菜品系寧油12種子的cDNA中克隆出一個全長為1350 bp的FatB基因，命名為BnFatB，并對其進行生物信息學分析。結果表明，BnFatB含有一個長度為1245 bp的開放閱讀框(ORF)，預測是編碼一個含有414個氨基酸殘基，其分子量為47.6 kDa，等電點為8.82的多肽，其中1-96位氨基酸為N-末端的葉綠體轉運肽的裂解位點，H319和C354為該序列中兩個關鍵的氨基酸殘基。序列分析顯示，BnFatB的編碼氨基酸序列與

4、BjFatB、AtFatB和MtFatB序列高度同源。BnFatB基因序列已遞交GenBank數(shù)據(jù)庫(GenBank: KC445243)。進化分析顯示，BnFatB與BjFatB具有最近的親緣關系，這也與它們物種間親緣關系表現(xiàn)一致。
　　 進一步分別通過實時熒光定量PCR方法和煙草系統(tǒng)共定位的方法對該基因在油菜中的組織特異表達模式和亞細胞定位作了分析，研究結果顯示:油菜根、莖、葉、花和角果五個組織中均有表達，尤其是在發(fā)育的角果

5、中表達最顯著;亞細胞定位表明該基因被定位于葉綠體，與之前生物信息學預測結果一致。油菜油脂積累過程是從發(fā)育的角果到最終成熟的種子中，油脂合成途徑中脂肪酸從頭合成也是始于質體，鑒于此，我們初步確定油菜BnFatB在油菜油脂合成途徑中起著重要的作用。
　　 為了探究該基因在油脂代謝途徑中的功能，采用水解蛋白酶缺陷型pep4酵母真核表達系統(tǒng)，通過在酵母細胞內異源表達油菜蛋白BnFatB，分別利用氣相色譜、半定量和蘇丹黑染色的手段對轉基因

6、酵母細胞的表達情況進行分析。結果顯示:BnFatB基因在酵母細胞中表達水平與對照相比明顯增加;酵母脂肪酸的氣相色譜分析表明，與對照組相比C16∶0和C18∶0分別增加45.69％和21.66％;而C16∶1和C18∶1分別下降15.32％和30.58％。
　　 為了更深入鑒定油菜BnFatB的生物學功能，我們還構建了該基因抗性為潮霉素的植物表達載體pCXSN_CaMV35S_BnFatB_NOS，然后通過農(nóng)桿菌介導浸花法轉化了甘