日本七鰓鰻α-天冬氨酰二肽酶和棕櫚酰蛋白硫酯酶1的基因克隆、原核表達(dá)及生物活性研究.pdf

1、七鰓鰻是現(xiàn)存海洋生物中最原始的無頜類脊椎動物之一，身體結(jié)構(gòu)及生活習(xí)性高度保守，距今有3.5億年的歷史。本論文利用分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)方法首次從日本七鰓鰻（Lampetra japonica）白細(xì)胞中獲得了α-天冬氨酰二肽酶(α-aspartyl dipeptidase，AAD)和棕櫚酰蛋白硫酯酶1(palmitoyl protein thioesterase1，PPT1)的同源基因，通過基因克隆、重組表達(dá)及生物信息學(xué)方法對基因進(jìn)行

2、分析預(yù)測，為更好了解蛋白特性及活性奠定基礎(chǔ)。
　　AAD能夠特異性水解N末端為天冬氨酰的二肽，可用于合成現(xiàn)今世界上的兩大甜味劑阿力甜和阿斯巴甜。目前為止AAD在有頜類脊椎動物和細(xì)菌中已有所研究，但其生物活性在日本七鰓鰻這一古老的無頜類脊椎動物中還沒有研究。本論文是首次從日本七鰓鰻中克隆并鑒定了AAD基因。將克隆得到的基因連接到帶有組氨酸標(biāo)簽的表達(dá)載體pET-22b上，轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌Escherichia coli BL21(DE3)

3、中，用1 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并篩選重組蛋白表達(dá)的最適條件，SDS-PAGE分析結(jié)果。Lj-AAD ORF區(qū)為717 bp，編碼238個氨基酸，理論分子量為26.5 kDa，等電點(diǎn)為5.83。不含信號肽。表達(dá)后蛋白以包涵體形式存在。對其進(jìn)行變性和復(fù)性，并對酶活性進(jìn)行檢測。檢測酶蛋白對溫度和pH的穩(wěn)定性等酶學(xué)特性。特別的是Lj-AAD在低溫條件下活性顯著增加，能夠有效提高底物利用率。
　　PPT1能夠水解棕櫚酰蛋白的硫酯鍵，可通

4、過溶酶體降解途徑脫去棕櫚?；鞍椎孽；?。目前只有PPT1和?；鞍琢蝓ッ?（acyl protein thioesterase1，APT1）兩種酶被認(rèn)為是能夠去除棕櫚酰蛋白的棕櫚化修飾。本論文首次從日本七鰓鰻中克隆得到PPT1基因，將克隆得到的基因連接到帶有組氨酸標(biāo)簽的表達(dá)載體pET-22b上，轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，并篩選重組蛋白表達(dá)的最適條件，SDS-PAGE分析結(jié)果。日本七鰓鰻PPT1基因ORF區(qū)為