坦布蘇病毒山株SD-02的分離鑒定、DNA疫菌的構(gòu)建及其免疫效果.pdf

1、自2010年4月，在中國的許多地區(qū)暴發(fā)一種以蛋鴨、種鴨產(chǎn)蛋驟然大幅下降為主要臨床特征的疾病，病理特征為卵巢的充血、出血、變形和淋巴細(xì)胞浸潤，肝門管區(qū)間隙炎癥。經(jīng)病原的分離鑒定，該病是由坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)引起的一種新的傳染性疾病，加強對本病的研究對預(yù)防和控制坦布蘇病毒感染的發(fā)生具有重要意義。本研究對坦布蘇病毒山東株SD/02進(jìn)行了分離鑒定，成功構(gòu)建了含有坦布蘇病毒prM/E基因和-CpG-ODN的DNA疫苗

2、并進(jìn)行了體外瞬時表達(dá)和體內(nèi)接種試驗。試驗結(jié)果表明，所構(gòu)建的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)試驗鴨產(chǎn)生針對坦布蘇病毒的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有良好的免疫保護(hù)效果。通過本研究為坦布蘇病毒的疫苗研制提供了科學(xué)的試驗依據(jù)，奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 一、坦布蘇病毒山東株SD/02的分離鑒定
　　 從疑似感染TMUV病例中分離到一株病毒，采用RT-PCR方法、prM/E序列的測定分析和致病性試驗對分離株進(jìn)行了鑒定。分離毒株RT-PCR鑒

3、定結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物與預(yù)期大小一致，其產(chǎn)物序列與坦布蘇病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株相應(yīng)片段核苷酸的同源性達(dá)99％。該毒株的鴨胚半數(shù)致死量(ELD50)為10-2.67/0.2mL，腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為1.238。用該分離株對12日齡的櫻桃谷肉鴨進(jìn)行致病性試驗，結(jié)果顯示，分離毒株人工感染櫻桃谷肉鴨的癥狀及剖檢變化與自然感染病例相同，發(fā)病率為100％，死亡率為40％。
　　 二、坦布蘇病毒DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效果觀察
　　 在真核

4、表達(dá)載體pVAX1中插入一段人工設(shè)計并合成的具有免疫刺激作用的CpG寡核苷酸序列。設(shè)計一對特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)擴增出TMUV山東分離株SD/02的prM/E基因，將其克隆入真核表達(dá)載體pVAX1質(zhì)粒中，置于PCMV啟動子之下，CpG寡核苷酸序列之上，構(gòu)建成pVAX1-prM/E-CpG重組質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，采用間接免疫熒光和RT-PCR方法檢測到目的基因的表達(dá)。體外轉(zhuǎn)染試驗表明，所構(gòu)建的DNA疫苗

5、能夠在體外獲得表達(dá)，從而為動物試驗提供了必要的前體條件。
　　 將DNA疫苗pVAX1-prM/E-CpG按200μg/只的劑量，以及TMUV滅活苗分別免疫三周齡的櫻桃谷肉鴨。疫苗接種后每周采血一次，以間接ELISA方法檢測特異性抗體水平，結(jié)果顯示:接種DNA疫苗和滅活苗的試驗鴨血清中抗體水平明顯高于對照組，差異極顯著(P＜0.01); DNA疫苗組與滅活苗組抗體水平差異不顯著(P＞0.05)。
　　 將DNA疫苗pVA

6、X1-prM/E-CpG按200μg/只的劑量，以及TMUV滅活苗分別免疫4日的櫻桃谷肉。并于接種后第8天進(jìn)行攻毒試驗，統(tǒng)計死亡率和相對保護(hù)率，檢測不同時間外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)及比值變化情況、血清中生化指標(biāo)（谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、堿性磷酸酶、尿酸）以及細(xì)胞因子(IFN-γIL-6)的含量變化。免疫攻毒試驗結(jié)果顯示，與滅活苗免疫相比，DNA疫苗免疫可使攻毒保護(hù)率提高42.8％。與坦布蘇病毒感染組相比，D