茶多酚注射液在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分、茶多酚注射液在大鼠的血漿藥代動(dòng)力學(xué) 目的：建立反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中茶多酚（Tea polyphenols，TP）主要抗氧活性成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）的濃度，進(jìn)而研究其藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，為TP的新藥開發(fā)及臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：采用RP-HPLC法測(cè)定血漿樣品中EGCG和ECG的濃度。固定相采用Kr

2、omasil-C18色譜柱（4.6×150 mm，5μm），預(yù)柱為Kromasil-C18保護(hù)柱（4.6×20 mm ID，10μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%枸櫞酸溶液，梯度洗脫，UV檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。血漿樣品200μL，加20%維生素C水溶液20μL，30μg·mL-1香草醛（內(nèi)標(biāo)，IS）溶液20μL，乙酸乙酯（EtoAc）500μL提取2次，合并上層有機(jī)相，N2流下37℃水浴揮干，加20%乙腈（CH3CN）水溶液100μL復(fù)溶，漩

3、混1 min，4℃低溫離心（7500 r·min-1）10 min后，取上清液60μL進(jìn)樣，以峰面積比內(nèi)標(biāo)法定量。最低定量限和標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、日內(nèi)精密度、日間精密度、準(zhǔn)確度、萃取回收率、穩(wěn)定性按藥監(jiān)局指導(dǎo)原則進(jìn)行測(cè)定。雄性SD大鼠15只，隨機(jī)分為三組（n=5），即高劑量組（150 mg·kg-1）、中劑量組（100 mg·kg-1）和低劑量組（50 mg·kg-1），各動(dòng)物自尾靜脈注射給予TP后，于給藥前和給藥后不同時(shí)間點(diǎn)從內(nèi)眥靜脈收集血

4、漿樣品，應(yīng)用上述方法測(cè)定血藥濃度，經(jīng)3P97程序處理擬合房室模型，并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 結(jié)果：EGCG和ECG的保留時(shí)間（tr）分別為11.2 min和18.3 min，IS的保留時(shí)間為16.4 min，三者之間達(dá)到基線分離，并不受空白血漿和代謝物以及TP中其他成分的干擾。EGCG和ECG標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍分別為0.25～300μg·mL-1和0.1～60μg·mL-1，線性方程分別為Y=0.1404X+0.005059（r2

5、=0.9996，n=3）和 Y=0.1393X+0.0007530（r2=0.9997，n=3），日內(nèi)精密度RSD均小于7.97%，日間精密度RSD均小于12.99%，準(zhǔn)確度為86.12%～112.42%。EGCG和ECG的萃取回收率分別為79.80%～84.64%和76.59%～87.27%。血漿樣品-20℃保存至少一個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定；室溫保存至少8h內(nèi)穩(wěn)定；對(duì)照品儲(chǔ)備液-20℃保存至少兩個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定；血漿樣品經(jīng)EtoAc萃取后2～4℃保存至

6、少24 h內(nèi)穩(wěn)定。EGCG和ECG的血藥濃度時(shí)程符合二室模型線性動(dòng)力學(xué)過(guò)程。 結(jié)論：本文建立的RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中TP主要活性成分EGCG和ECG的濃度，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明特異性高、精密度好、回收率高。血藥濃度數(shù)據(jù)表明EGCG和ECG在本研究的劑量范圍內(nèi)呈線性動(dòng)力學(xué)，且消除快速，分布廣泛（Vd值遠(yuǎn)超過(guò)總體水體積）；與ECG相比，EGCG相對(duì)消除較慢，分布更廣，但清除率基本相同。 第二部分、茶多酚注射液在大鼠組

7、織中的分布 目的：建立RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定大鼠心臟、肝臟、腎臟和腦組織中TP主要活性成分EGCG和ECG的含量，研究其在組織中的分布特點(diǎn)，為TP的新藥開發(fā)及臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：采用RP-HPLC法測(cè)定大鼠心、肝、腎和腦組織中EGCG和ECG的含量。色譜條件與前述血漿藥動(dòng)學(xué)研究相同。上述組織以飽和生理鹽水按1 g：4 mL（心臟、肝臟和腦組織）和1 g：9 mL（腎臟）的比例制成勻漿。取組織勻漿樣品1mL

8、，加20%維生素C水溶液20μL，20μg·mL-1香草醛（IS）溶液20μL，乙酸乙酯（EtoAc）2 mL，漩混1 min，4℃低溫離心（7500 r·min-1）10 min后取上層有機(jī)相，置于另一離心管中，如此共萃取2次，合并2次萃取液，N2流下37℃水浴揮干，加20%乙腈（CH3CN）水溶液200μL復(fù)溶，漩混1 min，4℃低溫離心（7500 r·min-1）10 min后，取上清液60μL進(jìn)樣，以峰面積比內(nèi)標(biāo)法定量。最低定

9、量限和標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、同內(nèi)精密度、日間精密度、萃取回收率、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性按藥監(jiān)局指導(dǎo)原則進(jìn)行測(cè)定。健康雄性SD大鼠15只，隨機(jī)分為三組（n=5）。每組動(dòng)物均按100 mg·kg-1的劑量自尾靜脈注射給藥。三組受試大鼠分別于給藥后20 min，60 min和120 min取血后處死，立即解剖采集心臟、肝臟、腎臟和腦組織，應(yīng)用前述方法測(cè)定血藥濃度和上述方法測(cè)定各組織中的藥物含量。 結(jié)果：EGCG和ECG的保留時(shí)間分別為11.2 min

10、和18.3 min，IS的保留時(shí)間為16.4 min三者之間達(dá)到基線分離，并不受各空白組織勻漿和代謝物以及茶多酚中其他成分的干擾。各組織勻漿中EGCG和ECG標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均分別為0.25～20μg·mL-1和0.125～10μg·mL-1。心臟、肝臟、腎臟和腦組織勻漿中EGCG線性方程分別為：Y=0.7252X+0.001502（r2=0.9995，n=3），Y=0.7609X+0.06228（r2=0.9996，n=3），Y=1

11、.1210X+0.004801（r2=0.9989，n=3）和Y=0.8366X-0.02721（r2=0.9999，n=3）； ECG線性方程分別為：Y=0.7170X-0.001043（r2=0.9988，n=3），Y=0.6051X-0.02370（r2=0.9990，n=3），Y=1.1852X-0.05144（r2=0.9959，n=3）和Y=0.8303X-0.02856（r2=0.9999，n=3）。 結(jié)論：本文建

12、立的RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定大鼠心臟、肝臟、腎臟和腦組織勻漿中TP主要活性成分EGCG和ECG的含量，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明特異性高，精密度好。各組織數(shù)據(jù)表明EGCG和ECG在腎臟中含量最高，肝臟和心臟次之，腦組織中含量甚微，提示EGCG和ECG不易透過(guò)血腦屏障。 第三部分、茶多酚注射液自大鼠尿、膽汁和糞中的排泄 目的：建立RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定大鼠尿、膽汁和糞中茶多酚（TP）主要抗氧活性成分EGCG，ECG，EGC和EC的

13、濃度，研究其排泄特點(diǎn)，為TP的新藥開發(fā)及臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：采用RP-HPLC法分別測(cè)定大鼠靜脈注射100 mg·kg-1的TP后，不同時(shí)間段內(nèi)上述4種兒茶素類化合物在尿、膽汁和糞中的濃度/含量。尿、膽汁樣品的色譜條件與前述血漿藥動(dòng)學(xué)研究相同，但對(duì)糞樣品的色譜條件有所改進(jìn)。尿樣和膽汁以生理鹽水適當(dāng)稀釋，糞樣以甲醇制成10%的勻漿。各樣品以10μg·mL-1香草醛（Van）溶液作為內(nèi)標(biāo)（IS），經(jīng)乙酸乙酯（EtoAc

14、）液-液萃取后N2流下37℃水浴揮干，加20%乙腈（CH3CN）水溶液復(fù)溶，4℃低溫離心后，取上清液60μL進(jìn)樣，以峰面積比內(nèi)標(biāo)法定量。最低定量限和標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、日內(nèi)精密度、日間精密度、準(zhǔn)確度、萃取回收率和穩(wěn)定性按藥監(jiān)局指導(dǎo)原則進(jìn)行測(cè)定。健康雄性SD大鼠10只，隨機(jī)分為兩組（n=5）。每組動(dòng)物均按100 mg·kg-1的劑量自尾靜脈注射給藥。一組受試大鼠自膽管插管收集空白膽汁后給藥，收集不同時(shí)間段膽汁樣品；另一組收集空白尿樣和糞樣后，給

15、藥，收集不同時(shí)間段尿樣和糞樣。分別應(yīng)用上述方法測(cè)定膽汁濃度和尿樣、糞樣中的藥物濃度/含量。 結(jié)果：尿和膽汁色譜條件下EGCG、ECG、EGC和EC的保留時(shí)間分別為11.2 min、18.3 min、6.0 min和9.6 min，IS的保留時(shí)間為16.4 min；糞色譜條件下EGCG、ECG、EGC和EC的保留時(shí)間分別為15.25 min、21.63 min、7.72 min和13.77 min，IS的保留時(shí)間為17.69 mi