α-硫辛酸對半胱氨酸誘導靜脈內(nèi)皮細胞損傷后賴氨酰氧化酶表達的影響.pdf

1、目的:通過半胱氨酸(Hcy)誘導靜脈內(nèi)皮細胞損傷后賴氨酰氧化酶(LOX)的表達變化及α-硫辛酸(ALA)對LOX的調(diào)節(jié)作用,探討ALA對內(nèi)皮功能的保護作用及其機制,為ALA防治內(nèi)皮細胞功能損傷提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.將HUVEC-12細胞株進行人工傳代培養(yǎng)。
　　 2.加入不同濃度Hcy、ALA培養(yǎng)不同時間,用MTT法測定細胞存活量。
　　 3.運用共聚焦顯微鏡觀察不同濃度Hcy、ALA對

2、細胞內(nèi)活性氧(ROS)生成及清除情況。
　　 4.提取細胞RNA,RT-PCR后以MMP-2、LOX與β-actin的mRNA比值進行半定量分析。
　　 5.提取細胞蛋白,以LOX與β-actin的OD比值進行定量分析。
　　 結果:
　　 1.Hcy對內(nèi)皮細胞存活有明顯抑制作用。不同濃度Hcy處理后,細胞明顯受抑制,呈濃度依賴性(P＜0.01)。經(jīng)Hcy處理后加入不同劑量ALA,細胞存活量明顯上升,不同

3、組間差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 2.Hcy能誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生ROS,胞內(nèi)ROS含量隨Hcy濃度增加而升高。以Hcy處理后分別加入不同劑量ALA,胞內(nèi)ROS含量明顯減少,不同組間差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.Hcy呈濃度依賴性下調(diào)內(nèi)皮細胞LOX表達及上調(diào)MMP-2mRNA表達。RT-PCR結果提示予不同濃度Hcy處理后LOXmRNA表達明顯減少,呈濃度依賴性(P＜0.01)。MMP-2mRNA

4、表達隨Hcy濃度增加而升高。應用LOX抑制劑BAPN后,MMP-2mRNA表達明顯增加。除Hcy中、高濃度組外,其余各組間差異均具統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Westernblot結果提示LOX表達隨Hcy濃度增加而降低。不同組間差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 4.ALA可抑制Hcy刺激引起LOX表達下調(diào)及MMP-2上調(diào)。RT-PCR結果提示經(jīng)Hcy處理后分別加入不同劑量ALA,細胞LOXmRNA相對表達量呈上升趨勢。

5、MMP-2mRNA表達較Hcy組降低,應用BAPN后,MMP-2mRNA表達增加。不同組間差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Westernblot結果提示經(jīng)Hcy處理與加入ALA后比較,Hcy組細胞LOX蛋白明顯低于ALA組。經(jīng)重復測量方差分析,不同組間差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.ALA明顯增高受損內(nèi)皮細胞活性,提示ALA對內(nèi)皮細胞具有保護作用。
　　 2.Hcy可通過增加細胞胞內(nèi)

6、ROS生成引起內(nèi)皮細胞氧化損傷。予ALA干預后胞內(nèi)ROS含量下降,提示ALA可通過減少內(nèi)皮細胞ROS生成,改善細胞氧化應激損傷,達到保護內(nèi)皮細胞的作用。
　　 3.Hcy引起內(nèi)皮細胞MMP-2表達增加,可能是通過Hcy下調(diào)細胞LOX表達來實現(xiàn)的。提示Hcy可通過抑制細胞LOX表達引起MMP-2表達異常,促使ECM降解、改變血管壁彈性,從而導致內(nèi)皮功能障礙,這可能是Hcy引起動脈粥樣硬化的重要機制。
　　 4.ALA可干預