基于近紅外熒光的甲基化及其基因表達(dá)檢測新技術(shù)的研究.pdf

1、表觀遺傳學(xué)是研究不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)和調(diào)控的可遺傳變化，其中，甲基化是最常見的DNA表觀遺傳修飾。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。因此，甲基化與癌癥、衰老、老年癡呆等眾多疾病密切相關(guān)。為了研究DNA甲基化對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用，必須精確地檢測基因組中的DNA甲基化。目前，檢測DNA甲基化的方法各種各樣，但絕大多數(shù)程序較為繁瑣，且不能將甲基化檢測結(jié)果與基因

2、表達(dá)調(diào)控效應(yīng)聯(lián)系起來，難以用于基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的研究。因此，建立一種簡單而高效的可同步檢測DNA甲基化及其基因表達(dá)調(diào)控效應(yīng)的新技術(shù)非常必要。研究表明多種基因啟動子區(qū)相關(guān)CpG島的高甲基化所導(dǎo)致的表觀遺傳學(xué)沉默通常與疾病相關(guān)?；诖四康模Y(jié)合我們實(shí)驗(yàn)室多年研究的雙鏈DNA微陣列(dsDNA microarray)技術(shù)，我們建立了一種可同步檢測基因甲基化，特別是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS) DNA甲基化及其基因表達(dá)調(diào)控效應(yīng)的新方法

3、。同時(shí)，本課題對該技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)展，選取不同的固相載體材料分別從甲基化和基因表達(dá)檢測等方面入手進(jìn)行新技術(shù)的創(chuàng)新。
　　本論文取得的主要結(jié)果如下:
　　1.尼龍膜是一種合成的長鏈聚酰胺薄膜，對核酸和蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，近紅外熒光(NIRF)具有高靈敏度，高信噪(S/N)比等特點(diǎn)。基于以上兩種優(yōu)點(diǎn)，本研究建立了一種基于膜的近紅外熒光法(M-NIFA)檢測DNA甲基化及其基因表達(dá)調(diào)控。該方法基于雙鏈DNA微陣列(dsDNA mi

4、croarray)技術(shù)包含兩個(gè)檢測系統(tǒng)，即甲基化和轉(zhuǎn)錄本檢測系統(tǒng)。前者通過使用抗5-甲基-胞嘧啶抗體（5-MC抗體）檢測DNA甲基化，后者則通過生物素化的cDNA檢測基因的轉(zhuǎn)錄本。5MC-抗體和生物素的信號可以被近紅外熒光標(biāo)記的第二抗體和鏈霉親和素所報(bào)告，兩個(gè)檢測系統(tǒng)的可行性，可通過人工合成的修飾有甲基和生物素的寡核苷酸得以驗(yàn)證。本文最后選取結(jié)腸癌細(xì)胞（LOVO細(xì)胞）中已知的高甲基化基因p14ARF進(jìn)行甲基化和轉(zhuǎn)錄本的檢測，檢測結(jié)果表明

5、該方法的可靠性。該研究提供了一種新方法可以同時(shí)檢測DNA甲基化及基因表達(dá)調(diào)控，另外該方法免亞硫酸氫鹽處理和PCR擴(kuò)增，具有寬動態(tài)范圍和較高靈敏度。新技術(shù)的建立有助于更好的探索DNA甲基化及基因表達(dá)調(diào)控效應(yīng)。
　　2.DNA甲基化檢測過程中尼龍膜材料可以進(jìn)行多基因單樣品的檢測，但是修飾有特殊基團(tuán)（如活性NOS基團(tuán)）的微孔板則可以更為靈活的同時(shí)進(jìn)行多基因多樣品的檢測。因此，我們建立了一種新型的甲基化檢測技術(shù)-微孔型近紅外熒光法(W-N

6、IFA)檢測DNA甲基化。該方法實(shí)現(xiàn)甲基化檢測主要包含兩個(gè)步驟，即偶聯(lián)捕獲探針的微孔板捕獲超聲波打斷的基因組DNA片段，以及隨后的免疫學(xué)過程結(jié)合近紅外熒光成像技術(shù)。該研究中，我們通過人工合成的寡核苷酸進(jìn)行新方法的可行性探索，通過對不同癌癥細(xì)胞系的三類基因KIR3DL1（K562，慢性髓原白血病細(xì)胞），p14ARF(LOVO，結(jié)腸癌細(xì)胞）和TP53BP2（HepG2，肝癌細(xì)胞）啟動子區(qū)共9個(gè)基因位點(diǎn)的甲基化檢測，驗(yàn)證了該方法的可靠性。

7、r>　　3.微孔板、近紅外熒光結(jié)合雙鏈DNA微陣列技術(shù)，不僅可以檢測啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，還可以對基因表達(dá)調(diào)控效應(yīng)進(jìn)行探索，即mRNA分子豐度的檢測。近紅外熒光的高靈敏度，微孔板的靈活性以及雙鏈DNA微陣列技術(shù)的精確性使該方法的建立成為可能。本研究中，我們建立了一個(gè)基于近紅外熒光-基因表達(dá)檢測（NIRF-GED）的新技術(shù)。NIRF-GED的檢測過程主要包含三個(gè)步驟，即生物素標(biāo)記的cDNA的制備，微孔板雜交和NIRF標(biāo)記-鏈霉親和素的近紅

8、外熒光成像。本研究以轉(zhuǎn)錄因子NF-κB靶基因Ccl20、Cxcl2以及持家基因GAPDH為研究對象，利用寡核苷酸探針建立NIRF-GED技術(shù)的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過將HeLa細(xì)胞的總cDNA以濃度梯度與3種基因的固定探針雜交，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得這3種基因的cDNA分子數(shù)，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證NIRF-GED結(jié)果。結(jié)果表明NIRF-GED可以較為準(zhǔn)確地檢測這些基因在被檢測細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果還表明，NIRF-GED可以用來實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)

9、的絕對定量分析。因此，本研究提供了一種基因表達(dá)檢測的新方法。
　　4.修飾有特殊基團(tuán)的醛基玻片是一種重要的微陣列芯片。通過DNA微陣列形式在醛基玻片上排列多個(gè)捕獲探針，可以實(shí)現(xiàn)更高通量的檢測。本研究中，通過進(jìn)行近紅外-醛基玻片(S-NIFA)系統(tǒng)的建立及優(yōu)化、利用MeDIP和E2F-ChIP技術(shù)分別富集甲基化DNA片段以及目的蛋白結(jié)合的DNA片段，我們進(jìn)行了S-NIFA技術(shù)在甲基化及其對轉(zhuǎn)錄因子與TFBS互作研究方面的探索;結(jié)合基

10、因表達(dá)的熒光定量PCR技術(shù)，本文探討了DNA甲基化、基因表達(dá)及其對轉(zhuǎn)錄因子與TFBS互作的影響。本研究采用的醛基玻片有以下兩個(gè)優(yōu)點(diǎn):第一，實(shí)驗(yàn)材料的消耗，包括寡核苷酸的氨基修飾、初級抗體和熒光標(biāo)記的第二抗體將大大下降，使得這種方法的性價(jià)比更高。第二，各個(gè)基因位點(diǎn)間的實(shí)驗(yàn)均一性和相容性將通過在非常小的區(qū)域內(nèi)檢測多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)得到改善。該方法如果在原有基礎(chǔ)上繼續(xù)改進(jìn)，有望在其它核酸分子如病原微生物等的高靈敏性檢測方面發(fā)揮重要作用。
　　

11、5.胚胎發(fā)育是基因選擇性地按一定時(shí)空順序表達(dá)的過程。胚胎發(fā)育過程中，表觀遺傳對維持哺乳動物正常生命活動起著不可替代的作用。為進(jìn)一步探討甲基化及其對基因表達(dá)調(diào)控效應(yīng)的影響，我們對人胚胎肺細(xì)胞（HFL-Ⅰ細(xì)胞）的兩個(gè)重要E2F靶基因TP53BP2及Apaf-1的CpG島啟動子區(qū)進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測，分析甲基化易發(fā)區(qū)域及其與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)間的關(guān)系。在生物信息學(xué)預(yù)測的基礎(chǔ)上，我們針對目標(biāo)靶區(qū)域進(jìn)行了亞硫酸氫鹽測序，通過甲基化抑制劑處理細(xì)胞結(jié)合

12、熒光定量PCR反應(yīng)，我們考察了啟動子區(qū)甲基化分布及其對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、靶基因表達(dá)調(diào)控效應(yīng)的影響。結(jié)果表明兩個(gè)基因啟動子區(qū)均存在一定程度的甲基化，并且生物信息學(xué)預(yù)測的甲基化CpG與亞硫酸氫鹽測序測得的甲基化CpG部分重合，亞硫酸氫鹽測序?qū)嶒?yàn)測得的CpG甲基化還出現(xiàn)在某些重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上，提示兩個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控可能在一定程度上受到甲基化尤其是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)甲基化的影響;通過甲基化抑制劑5-氮雜脫氧胞苷處理細(xì)胞后，我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的基因

13、表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，進(jìn)一步說明在胚胎發(fā)育早期TP53BP2和Apaf-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在一定程度上受到甲基化的影響?？傊?，本研究結(jié)果對進(jìn)一步了解表觀遺傳調(diào)控及其對胚胎發(fā)育過程的影響提供幫助。
　　本研究建立的新技術(shù)在甲基化檢測方面無需亞硫酸氫鹽處理、免疫沉淀、PCR擴(kuò)增等繁瑣的程序，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)對甲基化多基因、多位點(diǎn)、正負(fù)鏈的高通量檢測;在基因表達(dá)檢測方面，與常規(guī)方法相比具有免PCR擴(kuò)增、靈敏度較高等特點(diǎn)。這些新方法豐富了DN