let-7b-5p靶向電針耐受大鼠Dusp1基因的研究.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)miRNA能與mRNA3'UTR區(qū)結(jié)合，干擾基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。近些年在有關(guān)miRNA與疼痛的研究越來越受到人們的關(guān)注。研究表明miRNA let-7b在傷害感受器神經(jīng)元中可通過TLR7/TRPA1影響疼痛。電針耐受是反復(fù)或持續(xù)電針引起的電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)下降，是針刺治療疼痛性疾病時(shí)的一種負(fù)調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)室利用miRNA深度測序與側(cè)腦室注射對應(yīng)的agomir、antagomir，發(fā)現(xiàn)let-7b-5p在電針耐受中可能發(fā)揮著重要作用。利用靶基

2、因預(yù)測軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)Dusp1基因可能是let-7b-5p的靶基因。Dusp1基因轉(zhuǎn)錄、翻譯成MKP-1，MKP-1是一類雙向特異性蘇/酪氨酸磷酸酯酶，不僅能使磷酸化的蘇氨酸/絲氨酸去磷酸化，還可使磷酸化的酪氨酸去磷酸化。此外，MKP-1的特異性選擇底物是p38，p38亦與炎癥、疼痛有密切關(guān)系。另有研究表明，干擾MKP-1的活性，可調(diào)節(jié)MAPKs分子信號通路，進(jìn)而減少疼痛發(fā)生，延緩疼痛發(fā)展。電針相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)電針能顯著降低足底炎性痛大鼠大腦

3、核團(tuán)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、延腦頭端腹內(nèi)側(cè)核及脊髓背角p38MAPK的磷酸化水平，證明了MAPK信號通路在電針鎮(zhèn)痛中的重要作用。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了let-7b-5p在大鼠神經(jīng)元細(xì)胞中能干擾Dusp1基因的轉(zhuǎn)錄后水平，并進(jìn)一步探索大鼠下丘腦中，let-7b-5p是否通過干擾Dusp1基因和（或）MKP-1蛋白表達(dá)量影響電針耐受。
　　通過體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞與轉(zhuǎn)染雙熒光素報(bào)告酶載體，試驗(yàn)組與對照組相比，let-7b-5p顯著抑制了psiCHECK

4、2-Dusp1-3'UTR-WT雙熒光素酶報(bào)告載體的熒光活性，證明let-7b-5p的靶基因?yàn)镈usp1基因。后續(xù)試驗(yàn)選擇6周齡雌性健康SD大鼠，共54只，體重210±20g。隨機(jī)分成Ago+EA組、Atg+EA組和CT+EA組，每組18只。其中，Ago+EA組大鼠接受側(cè)腦室注射agomir-let-7b-5p; Atg+EA組大鼠接受側(cè)腦室注射antagomir-let-7b-5p; CT+EA組大鼠接受側(cè)腦室注射stable neg

5、ative control（隨機(jī)堿基序列），側(cè)腦室注射完成后立即對試驗(yàn)大鼠左后肢足底趾面注射0.1mL完全弗氏佐劑(CFA)，建立炎癥疼痛模型。完成注射后24h，電針試驗(yàn)大鼠雙側(cè)“足三里”及“三陰交”穴，每次持續(xù)30min，每天1次，共電針7次;每次電針前后，測定試驗(yàn)大鼠足底機(jī)械觸痛閾和鼠尾熱輻射痛閾值。于電針第1d、4d、7d，各組隨機(jī)挑選6只，取下丘腦，用于測量下丘腦中MKP-1蛋白表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:電針第1d至第

6、4d，Atg+EA組大鼠足底機(jī)械痛閾變化率均顯著高于Ago+EA組大鼠;電針第1d與第3d，Ago+EA大鼠足底機(jī)械痛閾變化顯著低于CT+EA組。測量大鼠鼠尾熱輻射痛閾變化率，發(fā)現(xiàn)電針第1d至第7dAtg+EA組與Ago+EA組相比痛閾變化率均顯著升高，電針第5d至第7d痛閾變化率Atg+EA組顯著高于CT+EA組;電針第1d、3d與4d，Ago+EA大鼠足底機(jī)械痛閾變化顯著低于CT+EA組。MKP-1蛋白表達(dá)量測定顯示，電針第1d，A

7、go+EA組MKP-1表達(dá)量相較其他兩組顯著降低;電針第4d，CT+EA組MKP-1蛋白表達(dá)量與Atg+EA組沒有顯著差異，但Ago+EA組MKP-1表達(dá)量仍顯著低于另兩組;電針第7d，Atg+EA組MKP-1表達(dá)量顯著高于另兩組，CT+EA組與Ago+EA組相比沒有顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)通過體外靶基因驗(yàn)證和體內(nèi)痛閾變化率和MKP-1蛋白表達(dá)水平的檢測，確定了在大鼠下丘腦中，let-7b-5p可通過干擾Dusp1基因并影響MKP-1蛋白表達(dá)