肝癌患者術(shù)野血中癌細(xì)胞的示蹤研究.pdf

1、目的：檢測肝癌患者行手術(shù)治療時，術(shù)野出血中是否存在癌細(xì)胞；若存在，確定其數(shù)量并分析判定其功能特性。
　　 方法：本實驗為開放式研究。共納入85名實驗研究對象，其中行手術(shù)治療的肝癌患者45名，行手術(shù)治療的非腫瘤患者20名，健康志愿者20名。收集每名研究對象性別、年齡、體重，記錄肝癌患者腫瘤發(fā)生來源、腫瘤大小、病理類型、分化程度及非腫瘤患者的臨床診斷。使用自體血液回收機(jī)對27名肝癌患者的術(shù)中出血予以洗滌、回收250ml(本研究用20

2、ml，其余用于其它實驗。A組)，抽取18名肝癌患者切肝前和切肝后循環(huán)血各20ml(B1組、B2組)，抽取非腫瘤患者術(shù)中循環(huán)血20ml(C組)及20名健康志愿者循環(huán)血20ml(D組)，共103例血液樣本。(1)有核細(xì)胞分離：裂解紅細(xì)胞法富集含腫瘤細(xì)胞的有核細(xì)胞，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測和細(xì)胞涂片后免疫熒光染色；密度梯度離心法無菌分離含腫瘤細(xì)胞的有核細(xì)胞用于細(xì)胞培養(yǎng)。(2)腫瘤細(xì)胞的抗體標(biāo)記：流式細(xì)胞術(shù)使用熒光抗體CK19和CD133標(biāo)記腫瘤細(xì)胞

3、，免疫熒光法使用AE1/AE3和CD133標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，兩種方法中均使用熒光染料DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。(3)腫瘤細(xì)胞的識別與檢測：流式細(xì)胞術(shù)用于計數(shù)血液中不同分化能力的活癌細(xì)胞數(shù)量；免疫熒光法用于檢測癌細(xì)胞的分化能力及數(shù)量，即染色后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞特性并計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)量；細(xì)胞培養(yǎng)法用于檢測癌細(xì)胞的克隆增殖性，即原代培養(yǎng)10-15天，培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞生長情況并計數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)及克隆株數(shù)量，培養(yǎng)結(jié)束后行免疫熒光檢測，確定貼壁細(xì)胞或細(xì)胞克

4、隆株性質(zhì)。
　　 結(jié)果：(1)流式細(xì)胞儀實際檢測到的肝癌患者術(shù)野血中存在的的CK19陽性、CD133陽性、雙陽性的活細(xì)胞數(shù)量分別為4.1×106-11.4×106、2.3×106-6.1×106、0.3×106-4.3×106個(95％置信區(qū)間)。各組CK19陽性的活細(xì)胞數(shù)比較，肝癌患者術(shù)野血多于肝癌患者切肝前及切肝后循環(huán)血(P<0.05)，肝癌患者切肝前循環(huán)血陽性細(xì)胞數(shù)量少于非腫瘤患者循環(huán)血(P<0.05)，其余各組間無明顯差

5、別。CD133陽性活細(xì)胞在肝癌患者術(shù)野血組數(shù)量多于肝癌患者切肝前循環(huán)血、健康志愿者循環(huán)血組(P<0.05)，其余各組間比較無差別。雙陽性活細(xì)胞數(shù)僅在非腫瘤患者循環(huán)血組與健康志愿者循環(huán)血組之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。不同肝癌來源、病理類型及分化程度的肝癌患者術(shù)野血中的各類陽性細(xì)胞數(shù)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(2)免疫熒光法結(jié)果提示：肝癌患者術(shù)野血中存在的AE1/AE3陽性、CD133陽性及雙陽性細(xì)胞，個數(shù)分別為0.

6、7.3×107、0-1.35×108、0-1.92×108個(95％參考值范圍)。肝癌患者術(shù)野血雙陽性細(xì)胞個數(shù)明顯多于各組循環(huán)血中雙陽性細(xì)胞個數(shù)(P<0.05)。循環(huán)血液各組間陽性細(xì)胞數(shù)量比較，非腫瘤患者、健康志愿者與肝癌患者切肝后循環(huán)血的AE1/AE3陽性細(xì)胞數(shù)量比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。CD133陽性的細(xì)胞數(shù)量在所有組間均無差異(P>0.05)。A組中不同肝癌來源、病理類型及分化程度的樣本中的各類陽性細(xì)胞數(shù)量分別比較，差異均

7、無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(3)各組樣本細(xì)胞培養(yǎng)均發(fā)現(xiàn)有克隆株形成。A組25例樣本中有克隆株生成者為14例(56％)，B1、B2、C、D各組(n=18，18，20，20)的克隆生成率分別為5.6％、16.7％、5％、5％。A組克隆生成率明顯高于其余各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而各組循環(huán)血組間克隆生成率比較無差異(P>0.05)。A組中不同肝癌來源、肝癌病理類型及肝癌的分化程度的樣本克隆生成率均無明顯差異(P>0.05)，