人尿胰蛋白酶抑制劑對(duì)移植腎樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的作用及其在腎移植排斥中的意義.pdf

1、器官移植已成為終末期臟器衰竭的最佳治療方案,但排斥反應(yīng)嚴(yán)重威脅著移植器官的功能和存活,是器官移植成功的最大障礙。在當(dāng)前供體器官?lài)?yán)重短缺的情況下,如何有效抑制排斥反應(yīng),保證移植物長(zhǎng)期有功能存活、改善受者生活質(zhì)量是器官移植領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。尋求更加高效、低毒、低感染、低致瘤危險(xiǎn)性的特異性免疫抑制劑已成為當(dāng)前移植免疫學(xué)界研究的重點(diǎn)。因此,我們有必要重新通過(guò)排斥反應(yīng)發(fā)生機(jī)制去尋找干預(yù)的新靶點(diǎn)。
　　腎移植過(guò)程中移植腎經(jīng)歷缺血、缺氧導(dǎo)致移

2、植臟器的非特異性炎癥損傷,通過(guò)“危險(xiǎn)信號(hào)”激活固有免疫,促使樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)等抗原提呈細(xì)胞(antigen-presentingcells,APC)成熟,不僅分泌大量促炎細(xì)胞因子以激活更多的樹(shù)突狀細(xì)胞成熟,吸引其他炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)導(dǎo)致DC表型改變、抗原提呈能力增強(qiáng),當(dāng)血流再通后,以DC為主的供者成熟APC與受者T細(xì)胞接觸,通過(guò)直接識(shí)別模式激活受者T細(xì)胞,參與活化受者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng),介導(dǎo)排斥反應(yīng)發(fā)生。AP

3、C的活化是整個(gè)過(guò)程的核心,而目前的免疫抑制劑的作用主要是在針對(duì)排斥反應(yīng)的效應(yīng)性T細(xì)胞增殖階段的干預(yù),沒(méi)有對(duì)抗原提呈細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞活化階段進(jìn)行處理,因此我們嘗試在此階段進(jìn)行干預(yù)。
　　DC是目前所知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞、適應(yīng)性免疫的啟動(dòng)者,是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能直接激活初始型T細(xì)胞的APC。DC在攝取抗原或接受炎癥因子刺激后活化成熟,高表達(dá)MHCII、共刺激分子CD80、CD86以及細(xì)胞間粘附分子,因而抗原提呈、免疫活化功能

4、大大加強(qiáng);其表面高表達(dá)趨化固子受體CCR6和CCR7,并分泌趨化因子、IL-12、TNF-α等促炎細(xì)胞因子,介導(dǎo)中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),加重組織損傷。
　　蛋白酶抑制劑烏司他丁(UrinaryTrypsinInhibitor,UTI)具有很廣的抑酶譜,能抑制胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、磷脂酶A、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶、纖溶酶等多種絲氨酸水解酶活性。此外,還能抑制心肌抑制因子的產(chǎn)生,改善微循環(huán)、穩(wěn)定溶酶體膜,抑制溶酶體酶的釋放、清除氧

5、自由基、抑制炎癥介質(zhì)的釋放等功能。臨床上用于嚴(yán)重?zé)齻?、菌血癥、治療急性胰腺炎、多器官功能衰竭。
　　UTI不僅能夠抑制多種蛋白酶的活性,減輕組織損傷,減少“危險(xiǎn)信號(hào)”的釋放,而且前期大量研究發(fā)現(xiàn)UTI可以抑制IL-12、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的釋放。上述兩方面卻又是誘導(dǎo)DC成熟不可或缺的因素,因此,我們推測(cè)UTI能夠抑制DC成熟。本實(shí)驗(yàn)采用UTI處理DC,體外研究UTI對(duì)LPS介導(dǎo)腎臟DC成熟的抑制作用,并通過(guò)小鼠腎臟移植模型的

6、體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí)UTI對(duì)移植腎內(nèi)DC的抑制作用并探討其在減輕移植腎排斥反應(yīng)作用的意義。
　　第一章:烏司他丁抑制LPS介導(dǎo)小鼠腎臟固有樹(shù)突狀細(xì)胞成熟
　　目的:探討UTI對(duì)LPS介導(dǎo)小鼠rDC成熟的抑制作用。
　　方法:取C57BL/6J小鼠腎臟制備單細(xì)胞懸液,使用MACS(MagneticCellSorting)磁珠分選CD11c+的rDC,流式細(xì)胞儀鑒定rDC純度。LPS刺激24小時(shí)促使rDC成熟,給予不同濃度(

7、0~200U/mL)UTI處理,ELISA檢測(cè)上清液中IL-12的分泌水平;100U/mL的UTI處理后流式細(xì)胞儀檢測(cè)rDC表面MHCII、CD80、CD86分子,以觀(guān)察UTI對(duì)rDC表型及功能的影響;檢測(cè)趨化因子受體7(chemokinereceptor7,CCR7)的表達(dá),計(jì)數(shù)受巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3β(Macrophageinflammatoryprotein3β,Mip-3β)趨化進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)小室下層的CD11c+細(xì)胞數(shù)目,分析UT

8、I對(duì)rDC趨化能力的影響。
　　結(jié)果:LPS刺激促使rDC成熟,高表達(dá)MHCII、CD80、CD86分子并分泌大量IL-12,而UTI能夠抑制LPS介導(dǎo)表型和功能成熟。經(jīng)UTI處理CCR7分子的表達(dá)以及受趨化的CD11c+細(xì)胞數(shù)目顯著降低,表明可以抑制LPS介導(dǎo)的趨化能力上調(diào)。
　　結(jié)論:UTI能夠抑制LPS介導(dǎo)的小鼠腎臟樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和趨化能力上調(diào)。
　　第二章:小鼠腎臟移植模型的建立
　　目的:建立小鼠腎臟移

9、植模型,為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供支持。
　　方法:以C57BL/6(H-2b)小鼠建立同系腎臟移植模型,共30對(duì)。戊巴比妥鈉按50mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉。供體手術(shù):取腹部大十字切口入腹,將腸道移向右側(cè),充分顯露左腎。4根8-0線(xiàn)分別于腎血管水平上下分別結(jié)扎腹主動(dòng)脈及下腔靜脈,經(jīng)腹主動(dòng)脈灌注肝素鹽水至腎臟成土黃色,在腎靜脈與下腔靜脈連接處剪斷腎靜脈、腎動(dòng)脈下方2mm傾斜剪斷腹主動(dòng)脈,取出腎臟放入4°C冰箱。受體手術(shù):切除小鼠右腎,采用

10、供者腹主動(dòng)脈瓣對(duì)受者腹主動(dòng)脈、供者腎靜脈對(duì)受者下腔靜脈端側(cè)吻合。移植腎臟迅速變?yōu)榉奂t色。將移植腎輸尿管拉入受者膀胱,輸尿管固定于膀胱,關(guān)閉腹腔。4-7天后麻醉下摘除左腎,受者完全靠移植腎存活。
　　結(jié)果:供者手術(shù)時(shí)間28.1±3.2min,受者阻斷血流時(shí)間31.3±3.5min,受者整體手術(shù)時(shí)間58.5±8.5min。30例手術(shù)成功21例,成功率70.0％。失敗的原因:移植腎灌注不良,深靜脈血栓形成及受者不能耐受腎移植手術(shù)或二次手

11、術(shù)。
　　結(jié)論:我們成功建立小鼠腎臟移植模型,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供支持。
　　第三章:烏司他丁抑制移植腎樹(shù)突狀細(xì)胞成熟減輕移植腎排斥反應(yīng)
　　目的:探討UTI減輕小鼠腎移植后排斥反應(yīng)的作用及機(jī)制。
　　方法:以Balb/c(H-2d)為供者,C57BL/6(H-2b)為受者,制備小鼠腎移植模型。Sham組為空白組(Balb/c(H-2d)),不進(jìn)行腎移植也不給予UTI預(yù)處理;T組只進(jìn)行腎移植,不接受UTI預(yù)處理;UT組

12、受鼠進(jìn)行腎移植并且接受UTI預(yù)處理。術(shù)后檢測(cè)各組受鼠的血清肌酐(Serumcreatinine,SCr)水平,觀(guān)察各組移植腎組織病理改變,分析UTI對(duì)腎功能及急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。移植后24h通過(guò)RT-PCR檢測(cè)IL-6、IL-10、IL-17及TNF-α的表達(dá)以觀(guān)察移植腎的免疫狀態(tài);流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面MHCII、CD80、CD86分子,以觀(guān)察UTI對(duì)DC成熟的影響。
　　結(jié)果:術(shù)后,UT組與T組受鼠SCr水平有所升高,但UT組

13、始終保持在較低水平(P<0.001);與Sham組相比,T組受鼠的移植腎彌漫浸潤(rùn)單個(gè)核細(xì)胞,而UT組移植腎單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)情況較T組明顯減輕,腎小球及腎小管形態(tài)大致正常,表明UTI能夠減輕急性排斥反應(yīng),提高移植腎功能。移植后24h,UTI顯著抑制移植物內(nèi)IL-6、IL-17及TNF-α的mRNA表達(dá)并提高IL-10的表達(dá)(P<0.001);T組較Sham組移植腎內(nèi)DC表面高表達(dá)MHCII、CD80、CD86分子,而UT組MHCII、CD8