三種不同途徑移植骨髓間充質干細胞治療肝硬化模型大鼠的效果比較.pdf

1、干細胞具有很強的自我更新和分化的能力，在特定環(huán)境中可以定向分化為有功能的細胞。國內外的研究已經證實了干細胞在治療器官損傷及細胞再生中能夠發(fā)揮很獨特的作用，干細胞的研究已廣泛涉足到血液系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等領域。成體干細胞包括造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)和間充質干細胞(mesenchymAlstem cells，MSCs)。造血干細胞已經在血液疾病的治療中發(fā)揮了很好的療

2、效，為研究者們對干細胞在再生醫(yī)學的研究增強了信心，給許多疾病的治愈帶來了新的希望。間充質干細胞可以來源于骨髓、脂肪、臍血等組織。其中骨髓間充質干細胞作為人體中的一種成體干細胞，數(shù)量多，獲取方法簡單，抽取過程及抽取完后對身體影響較小，逐漸被學者們和臨床醫(yī)生所重視。在特定的環(huán)境中，骨髓間充質干細胞可以分化為各種成體細胞，促進損傷器官的修復，改善器官的功能。
　　 在肝損傷的修復中，干細胞可以轉分化為肝細胞，分泌白蛋白，促進肝臟的修復

3、，并改善肝臟功能。國內外基礎及臨床研究，已經證實了骨髓間充質干細胞移植對肝硬化、肝衰竭等疾病具有明確的治療作用。目前，在我國、日本、歐洲等國相繼已經開展了自體骨髓間充質干細胞對肝硬化的臨床治療，療效確切，目前暫未發(fā)現(xiàn)明顯副作用的報道。在臨床運用中，有關學者及醫(yī)生提出了關于移植途徑的問題，常見有三種移植方式治療終末期肝病，分別是門靜脈途徑、肝動脈途徑、外周靜脈途徑，到底哪種途徑移植干細胞的療效更好呢？然而，關于這方面的報道較少，為此我們擬

4、進行該問題的研究，闡明這三種移植途徑是否對肝硬化治療的療效有影響。
　　 為了模擬臨床中的干細胞移植治療肝硬化的特征，我們建立了大鼠肝硬化模型，并培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs，通過常用的三種途徑將骨髓MSCs 移植到模型大鼠體內，移植后4周觀察比較這三種途徑移植骨髓MSCs對肝硬化模型大鼠的療效差別，為臨床應用提供參考。
　　 研究方法：
　　 1、 購SD 雌性大鼠，58只，200～230g，利用四氯化碳液體橄欖油混合

5、液皮下注射和酒精喂養(yǎng)的方法，并逐漸增加四氯化碳和酒精的濃度，建立肝硬化大鼠模型。2月后將存活下來的肝硬化模型大鼠隨機分為肝硬化未移植組(n=8)、門靜脈移植組(n=8)、肝動脈移植組(n=8)、尾靜脈移植組(n=8)。
　　 2、 取健康SD大鼠骨髓，利用全骨髓貼壁的方法原代培養(yǎng)骨髓MSCs。
　　 3、 取第3代骨髓MSCs，利用CM-DiI 標記MSCs。
　　 4、分別通過門靜脈途徑、肝動脈途徑、尾靜脈途徑

6、將標記好的MSCs 移植到肝硬化模型大鼠體內。
　　 5、 移植后4周取肝組織行冰凍切片，Hoechst 染核，激光共聚焦顯微鏡觀察干細胞在肝臟的分布及數(shù)量。
　　 6、 取肝組織行HE和Masson 染色，觀察肝硬化程度。
　　 7、 檢測血清白蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、直接膽紅素、間接膽紅素、Ⅳ型膠原等指標。
　　 研究結果
　　 1、激光共聚焦顯微鏡觀察MSCs在肝內分布情況
　　

7、 計數(shù)每個視野下定植于肝組織中MSCs 數(shù)量，三種移植途徑分別為：門靜脈移植組22.80±2.12，肝動脈移植組25.04±2.36，尾靜脈移植組23.36±4.07，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，提示三種途徑移植MSCs，經過4周后定植在肝臟的MSCs的數(shù)量無明顯差異。
　　 2、肝臟大體形態(tài)改變及病理學檢查結果
　　 (1) MSCs 移植后4周，觀察肝臟大體標本外觀，見不同途徑移植組的大鼠肝硬化程度均有所減輕；肝

8、硬化未移植組的組織學仍呈現(xiàn)典型肝硬化改變。
　　 (2) HE 染色見移植后各組大鼠肝臟切片內肝細胞變性、壞死有所減輕，肝細胞索較規(guī)則，小葉結構稍變清晰，匯管區(qū)炎細胞浸潤減輕。
　　 (3) Masson 染色見移植后各組大鼠肝臟假小葉數(shù)量減少，肝組織內纖維束減少、變細。但三種不同途徑移植組的肝臟病理學改善程度無顯著區(qū)別。
　　 (4) 根據(jù)Masson 染色結果，按照Chevallier 肝纖維化組織學半定量計

9、分系統(tǒng)(SSS)評分，肝硬化未移植組：21.35±2.16，門靜脈移植組：11.48±1.66，肝動脈移植組：11.46±1.02，尾靜脈移植組：10.75±0.90，統(tǒng)計結果表明三種途徑移植MSCs后的大鼠肝臟的纖維組織較未進行MSCs 移植的肝硬化大鼠明顯減少(P＜0.05)；但三種途徑移植MSCs后的大鼠肝纖維化程度之間無顯著差異(P＞0.05)。上述結果提示移植后，肝細胞損傷減輕，肝硬化程度有所改善，但三種不同途徑移植組間改善程

10、度無明顯差異。
　　 3、血清學檢查結果
　　 通過三種途徑移植MSCs 到肝硬化模型大鼠體內，4周后發(fā)現(xiàn)移植組模型大鼠的肝功能均得到明顯改善，血清白蛋白較肝硬化未移植組顯著升高(P＜0.05)，轉氨酶、膽紅素較肝硬化未移植組顯著降低(P＜0.05)，Ⅳ型膠原較肝硬化未移植組顯著降低(P＜0.05)。
　　 結論
　　 1、骨髓MSCs 移植治療模型大鼠肝硬化，移植后4周肝纖維化程度降低，肝功能改善；