異氟醚預(yù)處理對內(nèi)毒素誘導(dǎo)幼豬急性肺損傷的影響及機制探討.pdf

1、第一部分吸入不同濃度異氟醚預(yù)處理對內(nèi)毒素誘導(dǎo)幼豬急性肺損傷的影響
　　 目的:1.建立內(nèi)毒素誘導(dǎo)幼豬急性肺損傷(ALI)模型,為ALI的研究提供動物實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　 2.從呼吸力學(xué)、氣體交換、血流動力學(xué)、炎癥反應(yīng)、肺臟病理形態(tài)等方面,比較不同濃度異氟醚(0.5MAC、1.0MAC及1.3MAC)預(yù)處理對內(nèi)毒素誘導(dǎo)幼豬急性肺損傷的影響。
　　 方法:
　　 24頭5～6周齡、9～14kg雄性幼豬隨機分成4組

2、,每組6頭。幼豬麻醉后行氣管插管、常規(guī)機械通氣,分離左頸內(nèi)動脈及左頸外靜脈,分別放置Picco動脈導(dǎo)管和中心靜脈導(dǎo)管,用于監(jiān)測血流動力學(xué)及輸注液體,每小時測定動脈血氣分析,同時監(jiān)測其生命體征以及相關(guān)呼吸參數(shù)。實驗動物隨機分為4組,每組6頭。LPS對照組(CON組,n=6),經(jīng)中心靜脈輸注脂多糖(LPS)20μg/kg,60min內(nèi)輸注完畢,ALI形成后,行機械通氣12h后處死實驗動物;0.5MAC、1.0MAC、1.3MAC異氟醚預(yù)處理

3、組(分別為0.5MAC組,1.0MAC組,1.3MAC組,每組n=6),分別吸入0.5MAC、1.0MAC、1.3MAC異氟醚預(yù)處理30min,1h后再經(jīng)靜脈輸注LPS20μg/kg.ALI形成后,行機械通氣12h后處死實驗動物。分別在基礎(chǔ)狀態(tài)(Baseline)、LPS輸注后1h(LPSlh)、LPS輸注后2h(LPS2h)、急性肺損傷形成時(ALI0h)、急性肺損傷形成4h(ALI4h)、急性肺損傷形成8h(ALI8h)、急性肺損傷

4、形成12h(ALI12h),監(jiān)測呼吸力學(xué)、氣體交換、血流動力學(xué)、血氣分析等各項指標(biāo);實驗結(jié)束后留取肺泡灌洗液(BALF)檢測總蛋白(TP)、磷脂含量、肺泡表面張力;檢測肺濕干重比(W/D)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA),及肺組織病理檢查;利用放免法測定血漿中TNFα濃度。
　　 結(jié)果:1.27頭幼豬經(jīng)靜脈輸注20μg/kgLPS,實驗過程中意外死亡3頭。LPS輸注3～6h后可誘導(dǎo)出ALI。ALI判定標(biāo)準(zhǔn)為PaO2/F

5、iO2≤300mmHg,肺動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)與基礎(chǔ)相比下降30％以上。
　　 2.血流動力學(xué):LPS靜脈注射后,實驗初始階段0.5MAC組與1.3MAC組相比,0.5MAC組實驗動物HR、MABP、CO、SVR及dp/dtmax的較基礎(chǔ)值改變大。通過對PVPI的監(jiān)測發(fā)現(xiàn),1.3MAC組隨著實驗時間延長,其PVPI較CON組顯著增加(P＜0.05)。
　　 3.呼吸力學(xué)和氣體交換:LPS靜脈注射后,各組觀察時點與基礎(chǔ)值

6、相比,其中1.0MAC組MAP、Vd/Vt、pH及PaO2/FiO2變化幅度小。
　　 4.肺部炎癥反應(yīng):各組間比較未見統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 5.血常規(guī)及肝功能:各組間比較未見統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 6.血漿TNFα動態(tài)改變:LPS靜脈注射后,各組TNFα均增高,其中1.3MAC組血漿TNFa在ALI形成后與其他3組相比增高幅度降低。
　　 7.磷脂、TP含量、肺泡表面張力及肺W/D:1.0MAC組BALF中T

7、P及肺W/D與CON組相比降低(P＜0.05);磷脂及肺泡表面張力各組間比較未見統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 8.肺組織病理學(xué)檢查:各組間比較未見統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)論:1.成功建立了靜脈注射20μg/kgLPS(E.coli0111:B4)誘導(dǎo)的幼豬急性肺損傷動物模型。
　　 2.和其他兩個濃度異氟醚預(yù)處理相比較,1.3MAC異氟醚預(yù)處理對膿毒癥時循環(huán)功能有一定穩(wěn)定和保護(hù)作用。此外,該濃度異氟醚預(yù)處理后對血漿TNFα上

8、升有輕微地抑制作用。
　　 3.1.0MAC異氟醚預(yù)處理可以改善LPS誘導(dǎo)ALI時呼吸力學(xué)、氣體交換及氧合的改變,降低LPS誘導(dǎo)ALI時肺泡毛細(xì)血管通透性。
　　 第二部分線粒體ATP敏感性鉀通道在異氟醚預(yù)處理內(nèi)毒素誘導(dǎo)幼豬急性肺損傷中的作用
　　 目的:觀察阻斷線粒體ATP敏感性鉀通道(MitoKATPchannel)對1.0MAC異氟醚預(yù)處理后內(nèi)毒素誘導(dǎo)幼豬急性肺損傷的影響。
　　 方法:
　　

9、 實驗動物及試驗準(zhǔn)備同第一部分。實驗用豬6頭,經(jīng)靜脈輸注MitoKATP通道特異性阻斷劑5-羥基葵酸鹽(5-HD)5mg/kg,30min后,1.0MAC異氟醚預(yù)處理30min,1h后靜脈輸注LPS,ALI形成后,行機械通氣12h后處死實驗動物,該組為5.HD組(n=6),對照組為第一部分實驗中CON組及不同濃度異氟醚預(yù)處理組。實驗過程中各項觀察指標(biāo)及動物處死后留取標(biāo)本方法、檢測項目均同第一部分。
　　 結(jié)果:
　　

10、5-HD組各項血流動力學(xué)指標(biāo)與1.0MAC組進(jìn)行比較,兩組測得的各項血流動力學(xué)指標(biāo)與基礎(chǔ)值相比變化幅度相似,組間比較未見統(tǒng)計學(xué)差異。血氣分析pH在LPS1h點,與基礎(chǔ)值相比,5-HD組pH值顯著下降(P＜0.01),而1.0MAC組與基礎(chǔ)值相比未見統(tǒng)計學(xué)差異。PaO2/FiO2在LPS1h,與基礎(chǔ)值相比,5-HD組顯著下降(P＜0.01),而1.0MAC組則未見統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 監(jiān)測外周血白細(xì)胞(WBC)計數(shù),發(fā)現(xiàn)5-HD組在

11、ALI4h與ALI8h點的外周血WBC技術(shù),與CON組和1.0MAC組相比顯著減少(P＜0.01)。肝功能檢測發(fā)現(xiàn)隨著實驗時間延長,5-HD組總膽紅素(TBIL)和結(jié)合膽紅素(CBIL)增高顯著,5-HD組TBIL在ALI8h點較CON組增高且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);5-HD組CBIL在ALI0h、ALI8h點較CON組增高(P＜0.05)。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)隨實驗時間延長逐漸增高。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、AST各組間相同時點比較

12、未見顯著性差異。放免法檢測血漿TNFα動態(tài)變化,在ALI4h點,5.HD組TNFα較1.3MAC組增高(P＜0.05)。
　　 5-HD組與CON組及1.0MAC組相比MPO含量增高(P＜0.05),BALF中TP及TPL與CON組相比減少(P＜0.05),而肺W/D、MDA,5-HD組與CON組、1.0MAC組相比未見顯著差異。
　　 結(jié)論:1.使用MitOKATP通道阻斷劑5-HD后,與1.0MAC組相比,對肺損傷時

13、肺毛細(xì)血管通透性影響無統(tǒng)計學(xué)差異,提示MitoKATP通道開放與否對肺損傷時肺泡毛細(xì)血管通透性無影響。
　　 2.使用MitoKatp通道阻斷劑5-HD后,1.0MAC異氟醚預(yù)處理加重內(nèi)毒素誘導(dǎo)ALI時肺部炎癥。5-HD組BALF中TPL減少,提示MitoKATP通道關(guān)閉后,在炎癥時肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞(AECⅡ)受損和凋亡增多,致使TPL,合成減少,炎性反應(yīng)加重。
　　 第三部分異氟醚預(yù)處理對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷肺組織粘附

14、分子及炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響
　　 目的:
　　 研究不同濃度異氟醚預(yù)處理及使用MitoKATP通道阻斷劑后對內(nèi)毒素誘導(dǎo)幼豬ALI肺組織粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、炎性細(xì)胞因子(TNFα,IL-6,IL-8)mRNA表達(dá)以及肺組織ICAM-1蛋白表達(dá)的影響,探討可能存在的分子機制。
　　 方法:
　　 動物模型和實驗分組設(shè)計同第一、二部分。動物處死后,取部分右肺中葉于液氮保存。動物實驗

15、全部結(jié)束后,進(jìn)行肺組織RNA提取,逆轉(zhuǎn)錄后采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定肺組織ICAM-1、VCAM-1mRNA及TNFα、IL-6、IL-8mRNA表達(dá)量的相對定量,免疫組化方法檢測肺組織ICAM-1蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 5-HD組ICAM-1mRNA表達(dá)較1.0MAC組增高(P＜0.05),與其他組相比未見統(tǒng)計學(xué)差異。VCAM-1mRNA表達(dá)各組之間變化幅度不大,未見統(tǒng)計學(xué)差異,其中1.0

16、MAC組和5-HD組拷貝數(shù)最低。炎性因子TnαamRNA各組之間比較未見統(tǒng)計學(xué)意義。IL-6mRNA各組拷貝數(shù),CON組最高,但組間比較未見統(tǒng)計學(xué)意義。IL-8mRNA各組間比較,5-HD組表達(dá)最高,與CON組、0.5MAC組、1.0MAC組以及1.3MAC組相比有顯著差異(P＜0.05)。使用免疫組化技術(shù),可見各組肺組織ICMA-1表達(dá)于肺血管內(nèi)皮、肺泡上皮及支氣管上皮。
　　 結(jié)論:
　　 1.5-HD組肺組織ICA