Imipramine對內(nèi)毒素誘導的小鼠急性肺損傷的抗炎癥、抗凋亡作用的研究.pdf

1、實驗目的:
　　急性肺損傷(acute lung injury,ALI)的臨床發(fā)病率和病死率均較高,目前臨床各種治療手段尚未能使其病死率明顯下降。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導小鼠炎癥性肺損傷為研究對象,探討通過imipramine抑制應激狀態(tài)下神經(jīng)酰胺生成的關(guān)鍵酶酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASMase)是否對急性肺損傷具有保護作用。炎癥反應和細胞凋亡是急性肺損傷

2、發(fā)生、發(fā)展的重要病理過程,本課題就imipramine對LPS誘導的小鼠急性肺損傷中肺組織炎癥反應和肺組織細胞凋亡的兩方面的影響進行研究并探討相關(guān)分子機制,為通過調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺的生成治療急性肺損傷提供一定的理論依據(jù)。
　　實驗方法:
　　采用LPS腹腔注射的方法誘導小鼠急性肺損傷的動物模型,并在LPS誘導前30min給予imipramine干預,按照處理方式的不同分為四組:Sham+imipramine,Sham+vehicl

3、e,LPS+imipramine和LPS+vehicle。記錄生存時間,計算不同實驗組的生存率;觀察不同時間點不同實驗組中急性肺損傷各指標(肺組織病理學變化、W/D(Wet/Dry,濕干重比)、MPO(myeloperoxidase,髓過氧化物酶)、肺組織炎癥因子mRNA表達、支氣管肺泡灌洗液和血清中炎癥因子表達和細胞凋亡的指標(Bcl-2和Bax蛋白含量)的變化;通過對NF-κB(nuclear factor kappa B,核因子k

4、appa B)活性和含量、p38、JNK和Txnip(thioredoxin-interacting protein,硫氧還蛋白反應蛋白)蛋白表達的檢測,進一步探討imipramine抑制小鼠急性肺損傷的炎癥反應和凋亡的分子機制。
　　實驗結(jié)果:
　　1.腹腔注射LPS誘導小鼠炎癥性肺損傷,其模型容易復制,肺損傷程度較穩(wěn)定、均勻,肺組織病理變化也證實符合小鼠急性肺損傷的病理改變。
　　2.在LPS誘導急性肺損傷前30m

5、in給予小鼠imipramine干預可以顯著改善急性肺損傷小鼠的生存率(P＜0.05)。
　　3.肺組織病理學改變及評分:imipramine的應用改善了LPS誘導的小鼠肺組織的病理損傷,并且通過肺組織損傷病理評分,我們發(fā)現(xiàn)imipramine干預在12h(9.65±0.43VS11.9±0.80,P＜0.05)、18h(11.05±0.73VS14.30±0.39,P＜0.05)顯著降低了急性肺損傷小鼠肺組織病理損傷評分。這表明

6、imipramine可以減輕LPS誘導的肺組織病理損傷。
　　4.肺組織W/D:LPS誘導小鼠急性肺損傷后,肺組織W/D增加,12h達到高峰5.24±0.11。與LPS+Vehicle組相比,LPS+imipramine組肺組織W/D在6h(4.80±0.04VS5.16±0.05,P＜0.05)、12h(4.87±0.11VS5.24±0.11,P＜0.05)和18h(4.77±0.07VS5.14±0.03,P＜0.05)均顯

7、著降低。
　　5.肺組織MPO活性:LPS誘導小鼠急性肺損傷后,肺組織MPO活性增加,18h達到高峰37.55±5.67Units/min/mgprotein。與LPS+Vehicle組相比,LPS+imipramine組肺組織MPO活性在12h(10.10±1.28Units/min/mgproteinVS28.48±7.53Units/min/mgprotein,P＜0.05)和18h(11.39±1.36Units/min/

8、mgproteinVS37.55±5.67Units/min/mgprotein,P＜0.05)均顯著降低。
　　6.支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子濃度:TNF-α和IL-10在6h的基礎水平分別是218.50±22.11pg/ml,和83.02±15.33pg/ml。LPS刺激后TNF-α和IL-10水平均明顯升高。在LPS刺激6h后TNF-α和IL-10水平達到最高峰,分別為3860.31±274.80pg/ml和2809.00±

9、143.70pg/ml。Imipramine干預在6h和12h顯著降低了TNF-α(6h:2204.00±242.30VS3860.31±274.80,12h:2236.00±348.0VS3612.00±412.70,P＜0.05)和IL-10(6h:1645.00±222.50VS2809.00±143.70,12h:1463.00±137.80VS2117.00±117.20,P＜0.05)水平。
　　7.血清中炎癥因子濃度

10、:LPS刺激后血清中TNF-α和IL-10的變化趨勢與其在支氣管肺泡灌洗液中變化趨勢相似。TNF-α和IL-10在6h的基礎水平分別是228.90±54.72pg/ml,236.55±45.92pg/ml。LPS刺激后TNF-α和IL-10水平均明顯升高。在LPS刺激6h后TNF-α和IL-10水平達到最高峰,分別為3619.76±376.30pg/ml和3261.16±484.70pg/ml。Imipramine干預也在6h和12h顯

11、著降低了TNF-α(6h:1871.00±435.70VS3619.76±376.30,12h:1250.00±329.40VS2832.00±201.10,P＜0.05)和IL-10(6h:1755.00±281.50VS3261.16±484.70,12h:1283.00±153.80VS2221.00±330.00,P＜0.05)水平。
　　8.肺組織炎癥因子mRNA表達:LPS刺激后肺組織中炎癥因子mRNA表達均顯著增加。

12、與LPS+Vehicle組相比,LPS+imipramine組肺組織中TNF-αmRNA表達水平在6h和12h顯著降低,IL-6mRNA表達水平在18h顯著降低,IL-10mRNA表達水平在6h顯著降低。
　　9.NF-κBp65活性和含量:LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型中小鼠肺組織NF-κBp65活性和含量均顯著增加,而imipramine干預可以在6h和12h顯著抑制LPS誘導的NF-κBp65活性的增加,并在12h顯著抑制L

13、PS誘導的NF-κBp65含量的增加。
　　10.肺組織凋亡指標:imipramine干預可使Bcl-2蛋白表達量增加,Bax蛋白表達量減少,即imipramine干預可以減輕肺組織凋亡。
　　11.imipramine干預可以顯著抑制LPS誘導的pp38、pASK1和Txnip蛋白表達的增加。
　　結(jié)論:
　　1.在LPS誘導急性肺損傷前30min給予小鼠imipramine干預可以顯著改善急性肺損傷小鼠的生存