自噬和凋亡在晚發(fā)型Pompe病發(fā)病機(jī)理中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　Pompe病又稱作糖原貯積?、蛐?，為常染色體隱性遺傳，是由于溶酶體內(nèi)酸性α-糖苷酶（acid alpha-glucosidase，GAA）缺陷引起，可發(fā)生于任何年齡。酸性α-糖苷酶(GAA)主要負(fù)責(zé)在溶酶體內(nèi)降解糖原為葡萄糖，其缺陷可導(dǎo)致多種組織內(nèi)溶酶體糖原不能被降解而蓄積。Pompe病是世界上第一種被確定的溶酶體貯積病，同時也是唯一的既是糖原貯積病又是溶酶體貯積病的致死性疾病。Pompe病臨床異質(zhì)性很強(qiáng)，根據(jù)發(fā)病

2、年齡、疾病進(jìn)展速度以及受累器官嚴(yán)重程度將其主要分為兩大類:嬰兒型和晚發(fā)型。嬰兒型主要表現(xiàn)為心肺功能障礙，而晚發(fā)型臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肢帶肌無力，此外還包括一些特殊的臨床表現(xiàn)形式如急性呼吸功能不全和表現(xiàn)為椎基底動脈或頸內(nèi)動脈系統(tǒng)血管迂曲擴(kuò)張、多發(fā)狹窄、動脈瘤的腦血管病變。
　　一直以來糖原貯積?、蛐偷陌l(fā)病機(jī)制被認(rèn)為與肌細(xì)胞溶酶體內(nèi)過多的糖原累積而溶酶體沒有足夠空間進(jìn)行擴(kuò)展，以致溶酶體最終破裂有關(guān)即經(jīng)典的溶酶體腫脹

3、破裂理論。但是隨著近年來Pompe病動物模型的建立和酶替代治療的應(yīng)用以及電鏡技術(shù)的發(fā)展，自噬在Pompe病發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸受到重視。大量的實驗證明，自噬聚集和溶酶體腫脹破裂理論在Pompe病的發(fā)病機(jī)理中均占有一席之地，但是二者好像并不能同時為主。在嬰兒型患者其骨骼肌病理主要是以溶酶體腫脹破裂為主，經(jīng)過酶替代治療后自噬才變得更為明顯，而在晚發(fā)型患者其骨骼肌的主要病理特征則是自噬聚集。Pompe病不再單純的被認(rèn)為是一種糖原貯積病，溶酶體

4、不能降解糖原以及肌纖維各種自噬空泡的堆積共同導(dǎo)致肌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙、持續(xù)的自噬聚集以及明顯的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的異常，所述這些變化都會增強(qiáng)自噬活性以及影響肌纖維收縮性。上調(diào)或下調(diào)自噬活性都是在尋求一種平衡。所以調(diào)控自噬要找到平衡點，從而為尋求新的治療方法提供依據(jù)。
　　自噬最早于1962年由Ashford和Porten提出，是一種進(jìn)化上高度保守的溶酶體介導(dǎo)的降解過程，又稱為溶酶體自噬系統(tǒng)，是一種細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，主要分為三類:大自噬、微

5、自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。在生理狀態(tài)下自噬于大多數(shù)組織內(nèi)主要提供胞漿內(nèi)組分的常規(guī)循環(huán)，清除受損分子和異常聚集的蛋白質(zhì)，經(jīng)過代謝后的大分子被再利用，從而維持細(xì)胞內(nèi)組分生成與降解的平衡，而同時自噬更是細(xì)胞應(yīng)對饑餓和其它應(yīng)激狀態(tài)的一種生存機(jī)制。凋亡即Ⅰ型程序性死亡，定義為自殺式細(xì)胞死亡，以核染色質(zhì)濃縮為主要形態(tài)學(xué)特征，而自噬的特征為空泡內(nèi)胞漿內(nèi)容物被包裹后由溶酶體酶進(jìn)行降解，又稱為Ⅱ型程序性死亡，自噬和凋亡之間關(guān)系錯綜復(fù)雜。應(yīng)激狀態(tài)下自噬能移

6、除損傷的細(xì)胞器利于修復(fù)或者通過代謝細(xì)胞大分子提供額外的ATP有助于繼續(xù)生存，而隨著應(yīng)激狀態(tài)的變化自噬的作用也隨之轉(zhuǎn)換。凋亡在衰老、腫瘤、惡病質(zhì)、溶血、肥胖及燒傷引起的肌萎縮中的作用越來越受到重視。迄今為止有關(guān)凋亡在Pompe病發(fā)病機(jī)理中的作用機(jī)制尚不明確。凋亡和自噬的分子機(jī)制雖截然不同，但目前已有研究證實在自噬和凋亡的通路中存在一些共同調(diào)節(jié)分子，在某些條件下自噬能作為凋亡的上游或者是和凋亡一起觸發(fā)細(xì)胞死亡，提示凋亡和自噬在某種通路上存在

7、交叉點，可以相互影響，而且在特定的環(huán)境下自噬從保護(hù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)或直接參與細(xì)胞死亡，也可以說是在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的過程中細(xì)胞凋亡與自噬保持著動態(tài)平衡。已有實驗證實自噬和凋亡在衰老過程肌肉萎縮的病理機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，而有關(guān)二者在Pompe病發(fā)病機(jī)理的作用機(jī)制在國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本課題通過免疫組化、雙重免疫熒光等實驗方法，首次檢測了caspase-8在晚發(fā)型Pompe病患者活檢肌組織內(nèi)有無表達(dá)，首次檢測了VMP1和p62在晚發(fā)型Pompe

8、病患者活檢肌組織內(nèi)有無共表達(dá)，首次證實LAMP-2和cathepsin B可在晚發(fā)型Pompe病疾病發(fā)展的某一階段共表達(dá)于活檢肌組織，初步探討了自噬和凋亡在晚發(fā)型Pompe病發(fā)病機(jī)理中的作用機(jī)制，向明確晚發(fā)型Pompe病的發(fā)病機(jī)制又邁進(jìn)了一步，并為尋找Pompe病的新的治療靶點提供了實驗依據(jù)。
　　第一部分：觀察自噬和凋亡在晚發(fā)型Pompe病患者骨骼肌中的發(fā)生及分布特點
　　目的：
　　觀察LC3B、LAMP-2、VM

9、P1、p62和Bcl-2、cathepsin B在晚發(fā)型Pompe病患者骨骼肌活檢肌肉中的表達(dá)及特點。
　　方法：
　　總結(jié)分析進(jìn)行肌肉活檢的Pompe病患者10例，10例患者均為晚發(fā)型?？偨Y(jié)Pompe病患者的臨床資料和病理學(xué)特點，同時另選3例正常對照患者進(jìn)行肌活檢。所有活檢肌肉組織均分別進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)染色以及溶酶體相關(guān)

10、膜蛋白-2(lysosomeassociated membrane protein-2，LAMP-2)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule-associated protein1 light chain3B，LC3B)、空泡膜蛋白1(vacuole membrane protein1，VMP1)、p62、Bcl-2和cathepsin B的免疫組織化學(xué)染色。
　　結(jié)果：
　　1.10例Pompe病患者骨骼肌病理改

11、變
　　主要表現(xiàn)為肌纖維大小不等，其內(nèi)可見大量空泡，空泡形態(tài)不規(guī)則，部分空泡內(nèi)含嗜堿性顆粒樣物質(zhì)。偶見壞死及再生纖維，肌內(nèi)膜不同程度增生，肌原纖維間網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)紊亂，肌纖維內(nèi)糖原含量增多。病理表現(xiàn)個體差異較大，即使在同一患者骨骼肌標(biāo)本可出現(xiàn)部分區(qū)域肌纖維輪廓清晰，纖維內(nèi)也沒有空泡形成，僅呈裂隙狀，而另一區(qū)域卻可見大片結(jié)構(gòu)紊亂的肌纖維。
　　2.酸性磷酸酶染色結(jié)果
　　在HE染色明顯空泡化的區(qū)域，酸性磷酸酶染色呈弱陽性;在

12、HE染色呈紫紅色顆粒區(qū)域，酸性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽性;在空泡化不十分嚴(yán)重或者僅僅點狀分布區(qū)域，酸性磷酸酶染色亦呈弱陽性，且在肌纖維核心區(qū)域陽性表達(dá)。
　　3.免疫組化染色結(jié)果
　　LAMP-2、p62在10例患者肌組織內(nèi)均呈強(qiáng)陽性表達(dá)。而VMP1、LC3B、Bcl-2和cathepsin B在晚發(fā)型Pompe病患者活檢肌組織內(nèi)的表達(dá)程度變異較大。LC3B在多數(shù)肌纖維破壞較重的區(qū)域幾乎不表達(dá)或部分點狀弱表達(dá)，部分空泡化嚴(yán)重的肌纖維

13、內(nèi)陽性表達(dá)，尚未空泡化肌纖維核心區(qū)域呈點狀或團(tuán)塊樣陽性表達(dá)，不完全空泡化肌纖維呈弱表達(dá)。VMP1在空泡化較重的肌纖維內(nèi)不表達(dá)，在尚未完全空泡化的肌纖維內(nèi)可有陽性表達(dá)，Bcl-2在空泡化較重的肌纖維肌膜表達(dá)陽性，不完全空泡化的肌纖維內(nèi)弱陽性表達(dá)，而尚未空泡化的肌纖維部分弱表達(dá)。 cathepsin B在破壞較重的肌纖維內(nèi)不表達(dá)或者弱表達(dá)，在不完全空泡化或者尚未空泡化的肌纖維內(nèi)可呈陽性表達(dá);正常對照組各種染色均未見陽性表達(dá)。
　　結(jié)論

14、：
　　在晚發(fā)型Pompe病患者受累的骨骼肌組織中，LAMP-2、LC3B、VMP1、p62、Bcl-2、cathepsin B有著不同程度的表達(dá)，且分布區(qū)域不同，其與骨骼肌肌纖維破壞的程度相關(guān)，提示自噬和凋亡可能共同參與了晚發(fā)型Pompe病肌纖維結(jié)構(gòu)的破壞，在其不同的發(fā)展階段發(fā)揮著不同的作用。
　　第二部分：初步探討自噬和凋亡在晚發(fā)型Pompe病發(fā)病機(jī)理中的作用機(jī)制
　　目的：
　　檢測caspase-8(p1

15、8)的表達(dá)以及分別通過檢測LAMP-2和cathepsin B、LC3B的共表達(dá)，以及空泡膜蛋白1(vacuole membrane protein1，VMP1)和p62的共表達(dá)，以探討自噬和凋亡在晚發(fā)型Pompe病發(fā)病機(jī)理中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　選取行肌肉活檢的患者16例，其中晚發(fā)型Pompe病患者10例，3例脂質(zhì)沉積性肌病(lipid storage myopathy，LSM)患者、正常對照組3例。全部活檢標(biāo)本均

16、行LAMP-2、LC3B、caspase-8(p18)、cathepsin B、VMP1、p62免疫熒光染色，并用雙重免疫熒光方法分別檢測LAMP-2和LC3B、cathepsin B，VMP1和p62的共表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　免疫熒光染色顯示在空泡化明顯的晚發(fā)型Pompe病患者肌纖維內(nèi)主要可見LAMP-2和p62的強(qiáng)陽性表達(dá)，在LSM患者肌肉組織內(nèi)亦有不同程度的表達(dá)。LC3B、cathepsin B、VMP1、caspa

17、se-8(p18)染色結(jié)果接近，表現(xiàn)為在空泡化明顯的晚發(fā)型Pompe病患者肌纖維內(nèi)呈弱表達(dá)甚至不表達(dá)，而在受累肌纖維尚未空泡化或僅僅點狀改變時陽性表達(dá)。在尚未空泡化或者輕度空泡化的晚發(fā)型Pompe病患者肌纖維內(nèi)可以檢測到VMP1和p62的共表達(dá)以及LAMP-2和cathepsin B的共表達(dá)，共表達(dá)主要集中在肌纖維的核心區(qū)域。而在明顯空泡化的肌纖維內(nèi)，均未發(fā)現(xiàn)共表達(dá)。正常對照組各染色均無陽性表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　caspa