在自噬功能障礙情況下Nrf2調節(jié)失代償性心臟重構及功能障礙的機制研究.pdf

1、轉錄因子NE-2相關因子2（Nrf2）是堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子Cap‘n’Coall(CNC)家族的成員，Nrf2通過與一種順式增強子序列結合，我們稱之為抗氧化反應元件(ARE)，其核心核苷酸序列為‘5-RTGACNNNGC-3’，與這種增強子結合可啟動200多種歸屬于不同領域的基因的表達，包括抗氧化基因、Ⅱ相解毒酶、轉錄因子、轉運蛋白、清道夫受體以及分子伴侶蛋白等等。因此，Nrf2具有廣泛而復雜的生物學功能，從經典的抗氧化防御，到細胞

2、周期的調控和蛋白質量的控制。
　　Nrf2對心臟的保護作用已經在許多動物模型中證實，包括以主動脈弓縮窄術(TAC)引發(fā)心臟壓力負荷增加誘導的失代償性心臟重構和心功能障礙模型。從分子水平上分析，轉錄因子Nrf2啟動抗氧化蛋白以及解毒蛋白的表達，從而對抗氧化應激壓力導致的心臟損傷和功能失常。同時，研究發(fā)現(xiàn)Nrf2可促進自噬清除毒性的多聚泛素化蛋白聚集體的功能，從而保護心臟不受細胞內毒性蛋白的損傷。但是，與之前的結論相反，最近的研究發(fā)現(xiàn)

3、，在一種蛋白聚集誘發(fā)心肌病的小鼠動物模型中，這種模型通過向小鼠基因組內導入人來源的alpha B-晶狀體蛋白基因突變體（hCryABR120G）并進行小鼠老齡化實現(xiàn)，敲除Nrf2基因可以抵御心臟的還原壓力，減少多聚泛素化蛋白在心臟內的聚集，減緩心臟病理性肥大，改善心力衰竭。分析原因，持續(xù)性的Nrf2激活可能引發(fā)過度的還原壓力導致hCryABR120G誘發(fā)的心肌病。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)心肌特異性敲除Nrf2基因的小鼠對抗了TAC術后4周的壓

4、力負荷誘發(fā)的失代償性心臟重構和功能障礙，這與Nrf2介導還原壓力的理論相違背。另一方面，前期的研究也證明在自噬功能障礙的狀態(tài)下，Nrf2的激活導致了肝臟的損傷。另外，自噬功能障礙在小鼠CryABR120G(mCryABR120G)基因誘導的心肌病中起了重要作用，mCryABR120G基因和hCryABR120G基因有著幾乎相同的核苷酸序列，且衰老本身也伴隨著自噬功能不足或損傷，從這些關聯(lián)上看，衰老的hCryABR120G小鼠心臟中Nrf

5、2介導的負面作用很可能與自噬功能不足有關。綜上所述，在不同的病理狀態(tài)下，Nrf2對心臟的作用可能是保護性的也可能是損傷性的，這種雙面作用確切的機制目前還沒有研究清楚。
　　在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)心臟中Nrf2基因激活的病理生理學作用與自噬功能的完整性密切相關。自噬功能完整時Nrf2的激活對心臟的適應性反應起著重要作用，然而，在自噬功能障礙時，Nrf2的激活又介導了心臟的失代償性重構和功能障礙。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，自噬功能損傷可能是通

6、過阻斷核內Fyn控制的Nrf2向細胞核外的轉運，從而導致了Nrf2在核內積聚，啟動血管緊張素原的大量表達，進而惡化心臟失代償性重構，加重心功能損傷。
　　目的:
　　1、研究Nrf2在TAC手術誘發(fā)的壓力負荷引起的心臟重構和心功能障礙的病理進展過程中所起的作用;
　　2、研究Nrf2激活對心臟的作用與自噬功能狀態(tài)之間的關系;
　　3、探討在不同自噬功能狀態(tài)下，Nrf2影響心臟功能的具體機制。
　　方法:

7、r>　　第一部分:
　　1、用Nrf2基因敲除小鼠和野生型對照組小鼠進行主動脈弓縮窄手術，建立心衰模型，檢測術后存活狀況，在模型的早期EBD檢測心肌壞死，模型的晚期階段，超聲、qPCR、WGA、Masson、免疫組化檢測心臟重構狀況和心功能，分析不同病理生理學階段Nrf2基因敲除對心臟的影響;
　　2、通過對TAC術后的WT小鼠術后不同時間點進行自噬流的檢測，分析TAC術后不同階段自噬功能的狀態(tài);
　　3、運用心肌特異

8、性Atg5基因敲除小鼠建立自噬功能障礙心臟的TAC模型，觀察在自噬功能障礙時心臟的病理狀態(tài)以及Nrf2和其下游基因表達水平。
　　第二部分:
　　1、以qPCR和Western Blot的方法檢測自噬功能障礙小鼠心臟承受壓力負荷時心衰相關基因Agt的表達狀況;
　　2、以Western Blot的方法檢測自噬功能障礙對小鼠心臟承受壓力負荷時各信號通路激活水平的影響，并與Nrf2基因敲除小鼠心臟壓力負荷模型相對比，分析兩

9、者之間的聯(lián)系;
　　3、建立Nrf2/Atg5雙敲小鼠心臟壓力負荷動物模型，以免疫組化、western blot檢測更具體的分析Nrf2對壓力誘導心衰的病理生理作用與自噬功能的關系。
　　結果:
　　第一部分:
　　1、Nrf2基因敲除加重了TAC手術誘發(fā)的心臟急性損傷，但使手術引起的遠期的心臟重塑和心力衰竭得到了緩解;
　　2、在壓力負荷引起的心臟病程中，Nrf2激活所起的病理生理學作用與自噬功能的完整性

10、有關;
　　3、自噬功能障礙的小鼠心臟壓力負荷增加時，存在Nrf2的過度表達和激活。
　　第二部分:
　　1、在自噬功能缺失的壓力超負荷心臟中，Nrf2啟動Agt的表達;
　　2、在壓力負荷誘導損傷的心臟，自噬功能障礙阻斷了TAC誘導的Jak/Fyn通路的激活，使Nrf2向細胞核外轉運降解減少。
　　結論:
　　1、自噬功能完整時Nrf2激活對心臟起保護作用，而當自噬功能障礙時，Nrf2的激活加速了心