NSSR1在NCAML1、GLUR-B前體mRNA剪接和細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制.pdf

1、本課題組在以往的研究中，克隆了NSSR1基因并發(fā)現(xiàn)它在神經(jīng)系統(tǒng)中的特異分布以及它可以調(diào)節(jié)NCAM L1和Trk C的前體mRNA可變剪接。本論文在此基礎(chǔ)上研究了NSSR1基因在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的表達(dá)分布，NSSR1蛋白及其去磷酸化對前體mRNA可變剪接的調(diào)控以及它在P19細(xì)胞凋亡及分化中的功能。 我們首先系統(tǒng)的研究了NSSR1基因在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)各組織在發(fā)育過程中的表達(dá)以及分布情況，不同發(fā)育時期的小鼠全腦組織West

2、ern-blot結(jié)果顯示，NSSR1蛋白隨著胚胎發(fā)育其表達(dá)也不斷增加，其中增加最明顯的時間在E10-E12之間，在出生后NSSR1的表達(dá)趨于穩(wěn)定。大腦不同部位組織的Western-blot分析顯示NSSR1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各組分中都有表達(dá)。 通過對新生小鼠和成年小鼠不同組織的IHC結(jié)果顯示，NSSR1在新生小鼠大腦和成年鼠大腦中的表達(dá)分布有著較明顯的不同。在海馬中，新生小鼠大腦海馬中的NSSR1表達(dá)較低而成鼠的表達(dá)顯著增強(qiáng)。在成

3、鼠小腦中，NSSR1廣泛分布在小腦皮質(zhì)包括浦肯野氏等神經(jīng)元細(xì)胞中，而在新生鼠中主要在浦肯野氏細(xì)胞中表達(dá)。NSSR1在新生鼠和成鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的差異與神經(jīng)元的發(fā)育是密切相關(guān)的，海馬顆粒細(xì)胞在發(fā)育時序上是最晚形成的神經(jīng)元，因此在新生鼠海馬顆粒細(xì)胞中幾乎檢測不到NSSR1的表達(dá)，而在成鼠海馬中，NSSR1的表達(dá)非常強(qiáng)烈。而小腦浦肯野氏細(xì)胞是小腦中最早產(chǎn)生的神經(jīng)元，因此在發(fā)育早期NSSR1就有明顯的表達(dá)，然后隨著神經(jīng)元細(xì)胞的遷移，小腦皮層

4、的其它神經(jīng)元如顆粒細(xì)胞也開始表達(dá)NSSR1蛋白。與其它神經(jīng)組織中NSSR1主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)不同，視網(wǎng)膜中NSSR1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中。此外，NSSR1僅在新生鼠ONL中有少量表達(dá)，隨著發(fā)育NSSR1蛋白開始在成鼠INL、GCL層表達(dá)。視網(wǎng)膜中神經(jīng)元的發(fā)育屬于調(diào)節(jié)型發(fā)育(regulative development)，新生小鼠視網(wǎng)膜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)比較簡單，然后隨著發(fā)育其復(fù)雜程度不斷提高，NSSR1的表達(dá)與此一致。以往的研究(多數(shù)為體外剪接試

5、驗)顯示NSSR1可以調(diào)節(jié)β-Globin等基因前體mRNA的可變剪接，本課題組也發(fā)現(xiàn)NSSR1能夠調(diào)節(jié)兩個在神經(jīng)發(fā)育和功能中發(fā)揮重要作用的基因—內(nèi)源性NCAM L1和Trk C的前體mRNA剪接，為了深入研究NSSR1在體內(nèi)對前體mRNA剪接的調(diào)節(jié)作用，我們首先構(gòu)建了NCAM L1小基因，然后研究了NSSR1對該小基因exon2的剪接調(diào)節(jié)作用。在內(nèi)源表達(dá)NSSR1的Hela、PFSK細(xì)胞中，小基因被剪接產(chǎn)生兩個亞型(含exon2與不含

6、exon2)，而無內(nèi)源NSSR1的COS-1、R28細(xì)胞內(nèi)則只有一個亞型(含exon2)。另外，過表達(dá)NSSR1或siRNA也已經(jīng)證明可以影響內(nèi)源性NCAM L1基因exon2的剪接。然而接下來我們過表達(dá)NSSR1及其siRNA的實驗結(jié)果表明，NCAM L1小基因的可變剪接不受NSSR1的調(diào)控。我們的結(jié)果提示NSSR1在調(diào)節(jié)NCAML1基因exon2的剪接時可能需要我們構(gòu)建的NCAM L1小基因外的順式元件的參與。 在前體mRN

7、A剪接過程中，SR蛋白的磷酸化與其功能有密切關(guān)系。Shin等人的研究發(fā)現(xiàn)熱休克可以使NSSR1去磷酸化從而抑制β-Globin等基因前體mRNA的可變剪接。為了研究NSSR1的磷酸化狀態(tài)對內(nèi)源性NCAM L1基因可變剪接的影響，我們對PFSK細(xì)胞熱休克處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSSR1蛋白的去磷酸化形式增加，同時熱休克后，過表達(dá)NSSR1可以增加內(nèi)源NCAM L1基因不含Exon2的剪接亞型的產(chǎn)生。我們的結(jié)果說明在熱休克后，NSSR1也可以通過調(diào)

8、節(jié)被剪接基因不同剪接亞型的產(chǎn)生來幫助細(xì)胞進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)。接下來我們用非特異的激酶抑制劑K252a處理轉(zhuǎn)染的PFSK細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)K252a也可以促使NSSR1蛋白向去磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，同時PFSK細(xì)胞在K252a處理后，過表達(dá)NSSRl可以增加內(nèi)源NCAML1基因不含Exon2的剪接亞型的剪接，證明用非特異的激酶抑制劑K252a處理轉(zhuǎn)染的PFSK細(xì)胞，其對NSSR1蛋白的影響與用熱休克處理細(xì)胞一致。提示NSSR1的磷酸化狀態(tài)可以影響前體mR

9、NA的剪接。 同時我們也研究了NSSR1對GluR-B小基因前體mRNA剪接的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)NSSR1過表達(dá)可以促進(jìn)GluR-B小基因FLJP亞型(含Exon 14)的剪接。而熱休克以及K252a處理都促進(jìn)GluR-B小基因Truncate亞型(不含exon14、15)的剪接，說明NSSR1磷酸化狀態(tài)的改變同樣影響GluR-B小基因的剪接。 為研究NSSR1各功能域在調(diào)節(jié)可變剪接中的功能，我們用分別缺失RRM、RS1、R

10、S2、RS3等功能域的缺失突變克隆與GluR-B小基因共轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSSR1的各功能域在調(diào)節(jié)前體mRNA的可變剪接中都有作用，與野生型NSSR1比，三個RS功能域的分別缺失都使GluR-B小基因FUP亞型的剪接減少，而RRM功能域的缺失則使GluR-B小基因FLIP亞型的剪接增加。 前體mRNA剪接在細(xì)胞的程序性死亡中發(fā)揮重要作用，作為一個有著重要功能的SR蛋白，NSSR1可能在其中發(fā)揮作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，N

11、SSR1可以抑制由RA/BMP4聯(lián)合誘導(dǎo)的P19細(xì)胞凋亡，但RA單獨作用沒有效果，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，NSSR1可以促進(jìn)由RA/BMP4聯(lián)合誘導(dǎo)的P19向神經(jīng)元方向的分化，并且促進(jìn)其神經(jīng)突起的生長。在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程中，NSSR1有可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的可變剪接來發(fā)揮作用，目前我們正在對此可能性進(jìn)行驗證。 最后，我們建立了NSSR1的昆蟲表達(dá)體系，在果蠅細(xì)胞系S2細(xì)胞中成功的表達(dá)了NSSR1蛋白，為將來進(jìn)行體外剪接等研究打下