不同血型臍血清在干細胞體外擴增中的應用.pdf

1、目的：
　　 干細胞,如胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)、造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)或間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)等,具有自我更新和無限增殖的能力,并能在特定因素的影響或誘導下向血、心肌、骨、神經(jīng)、肝細胞等多譜系分化。因此,干細胞在臨床上的應用非常廣泛。但是,輸注給病人的細胞數(shù)量只有達到7×107/kg時才能發(fā)

2、揮有效的治療作用,相對于成人,單份采集的干細胞數(shù)量遠遠不足以達到臨床治療效果,故體外大規(guī)模有效擴增是干細胞應用于臨床細胞治療及組織工程學的關鍵環(huán)節(jié)。迄今為止,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS或fetal calf serum,FCS)因其含有較多的生長刺激因子和較少的生長抑制因子,仍是干細胞培養(yǎng)中應用最為廣泛的生長添加劑。但作為異種蛋白質(zhì),它本身有攜帶細菌、病毒、蛋白傳染性疾病或朊病毒的風險。另外,應用FBS/FC

3、S培養(yǎng)后的干細胞內(nèi)含有牛血清蛋白(7mg～30mg/108cells),可以使受者體內(nèi)產(chǎn)生抗牛蛋白抗體引起免疫反應,從而導致患者尤其在重復輸注干細胞治療后治療失效。因此FBS在干細胞臨床大規(guī)模培養(yǎng)中的不利因素已經(jīng)逐漸暴露出來,現(xiàn)已有很多學者研究FBS/FCS的替代品,其中較多的就是應用人血清或血清衍生物來替代。包括成人血清、血小板衍生物(血小板裂解液、凝血酶激活血小板釋放因子)、臍血清等。臍血清是一種富含干細胞生長存活所需的不同的細胞因

4、子的資源,對干細胞擴增更有刺激效應并維持細胞的未成熟狀態(tài)。同時臍血清作為醫(yī)療廢棄物,取自產(chǎn)婦分娩后,避免了胚胎等的倫理道德問題,故臍血清獲得相對更容易且更廣泛,且作為胎兒與母體的聯(lián)接紐帶,其免疫原性更低。因此本實驗選擇臍血清作為主要研究對象,對比其與胎牛血清的作用效果以及不同血型間的影響,為CBS在干細胞體外擴增中的應用,特別是臨床應用提供實驗依據(jù)。本實驗中所采用的細胞-人胎盤間充質(zhì)干細胞(human placenta-derivedm

5、esenchymal stem cells,hPDMSCs)來源于正常足月分娩的胎盤,它具有和臍血相同的來源容易、廣泛、免疫原性低等優(yōu)點,所提取的間充質(zhì)干細胞同骨髓間充質(zhì)干細胞有相同的特性:自我更新和無限增殖的能力且能向多譜系分化等。本實驗通過觀察細胞形態(tài)、檢測擴增細胞數(shù)量及所用時間、細胞周期以及培養(yǎng)前后細胞的表型、分化能力等方面的變化,對比胎牛血清與臍血清對人胎盤問充質(zhì)干細胞擴增的影響的同時,進一步探討了不同血型臍血清對不同血型同種異

6、體人胎盤間充質(zhì)干細胞擴增的影響。
　　 方法：
　　 1、分離培養(yǎng)hPDMSCS:取足月剖宮產(chǎn)胎兒胎盤子體面組織,PBS沖洗,剔除血管、神經(jīng),采用組織微塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hPDMSCs。
　　 2、臍血清(CBS)的提取:無菌條件下無抗凝取健康產(chǎn)婦足月臍血,靜置、離心、過濾,無菌檢測后分裝備用。
　　 3、細胞培養(yǎng)與擴增:方案一:同密度(6000個細胞/cm2)接種,每代均培養(yǎng)相同的天數(shù)(3d～4d),

7、作MTT檢測,再同原始接種濃度的細胞吸光度進行比較得出增殖比率來繪制各代增殖曲線。方案二:初始以6000個細胞/cm2密度接種后各代均1:2傳代,至細胞14d生長不足50％傳代終止。分別計算累積群體倍增數(shù)(cumulative population doublings,CPD)和細胞傳代時間(generation time)即細胞倍增的平均時間,檢測細胞增殖情況。
　　 4、細胞周期檢測:取P2、P10細胞,流式細胞分析儀檢測細

8、胞周期。
　　 5、細胞表面標記物與細胞分化能力檢測:取培養(yǎng)前、后的hPDMSCs,流式細胞儀檢測CD31、CD45、CD73、CD105、CD166的表達情況及誘導hPDMSCs向軟骨、內(nèi)皮方向分化。
　　 結果：
　　 1、胎盤中提取的hPDMSCs形態(tài):呈梭形或成纖維狀,可持續(xù)傳代生長。
　　 2、人胎盤組織來源的細胞表面標記特征:CD105、CD166,不表達CD31、CD34、CD45。

9、　　 3、hPDMSCs的擴增情況:
　　 (1)hPDMSCs形態(tài):CBS培養(yǎng)后細胞較小、更像兩端尖的紡錘形,同時細胞呈篩網(wǎng)狀生長。CBS較FBS維持的較小形態(tài)代數(shù)更長。不同血型CBS間細胞形態(tài)無明顯差別。
　　 (2)培養(yǎng)后hPDMSCs增殖情況:取培養(yǎng)較典型的不同的MTT值繪制曲線,TBD組細胞傳代數(shù)最少、峰值最低,以色列組次之,CBS組傳代數(shù)最多、峰值最高。
　　 (3)培養(yǎng)傳代代數(shù)和增殖后細胞數(shù)量:C

10、BS組細胞代數(shù)最長,ISA-FBS組次之,TBD-FBS組增殖代數(shù)最短,CBS組CPD均明顯高于ISA-FBS和TBD-FBS組。CBS組與FBS組差別有顯著意義(p<0.05),不同血型CBS組間差別無顯著意義(p>0.05)。
　　 (4)細胞周期流式分析:流式分析表明各組培養(yǎng)的細胞大部分處于G0/G1期,說明細胞有較強的增殖能力,P2代細胞分析無明顯差異,P10代時CBS組處于G0/G1期更多,ISA-FBS組次之,TBD

11、-FBS最低,FBS組與CBS組相比差別均有顯著意義(p<0.05。
　　 4、hPDMSCs表面標記特征及分化能力的變化:流式細胞儀檢測細胞表面標記在CBS培養(yǎng)前后無明顯改變。用CBS培養(yǎng)增殖后的細胞均可向軟骨、內(nèi)皮方向分化。
　　 結論：
　　 1、臍血清與胎牛血清相比,在hPDMSCs的體外擴增中,具有更強的促進細胞增殖能力。
　　 2、不同血型臍血清對不同血型來源的hPDMSCs體外擴增作用無顯著