TNF-α抑制骨髓間充質(zhì)干細胞參與糖尿病創(chuàng)面愈合的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病等疾病所引起的難愈性皮膚潰瘍是臨床治療的難點。延遲愈合的創(chuàng)面還容易形成增生性瘢痕,從而導(dǎo)致機體的功能障礙。目前,難愈性皮膚潰瘍的治療依然是整形外科臨床面對的挑戰(zhàn)之一。因此進一步明確難愈性皮膚創(chuàng)面愈合的機理,促進其早期修復(fù)是創(chuàng)傷研究領(lǐng)域的焦點問題。
　　皮膚創(chuàng)面的愈合是一個由多種細胞和細胞因子共同參與,并且涉及到炎癥反應(yīng)、肉芽形成、血管生成和組織重塑的復(fù)雜的病理生理過程。而慢性創(chuàng)面的主要特征是持續(xù)慢性炎癥

2、,肉芽組織和血管形成減少,細胞因子缺乏,低氧狀態(tài)和血供障礙。目前認為在糖尿病創(chuàng)面中,高濃度的TNF-α過度激活NF-κB是創(chuàng)面延遲愈合的一個重要因素;有研究證據(jù)表明抗TNF-α治療在減少糖尿病的并發(fā)癥方面是有益的。目前大量的研究證實了骨髓間充質(zhì)干細胞在皮膚創(chuàng)面的愈合過程中起到重要的作用。但骨髓間充質(zhì)干細胞參與上皮化愈合的過程和調(diào)控機理還不清楚,向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化尚有距離。同時在慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面中,骨髓間充質(zhì)干細胞聚集和角質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化障礙是創(chuàng)面

3、難愈合的重要原因。成纖維細胞合成功能下降和對生長因子的反應(yīng)性降低也是造成慢性創(chuàng)面難愈的重要因素,但成纖維細胞老化和失活的確切原因,迄今還不完全清楚。我們推測在糖尿病等慢性創(chuàng)面中,TNF-α過度激活NF-κB信號通路導(dǎo)致成纖維細胞功能低下,趨化因子缺乏是影響間充質(zhì)干細胞遷移到創(chuàng)面和參與上皮化愈合的重要影響因素。阻斷TNF-α的作用,能夠改善成纖維細胞功能,促進內(nèi)在的間充質(zhì)干細胞和移植的間充質(zhì)干細胞參與創(chuàng)面的上皮化愈合過程。
　　目的

4、：
　　本研究擬重點研究TNF-α/NF-κB信號通路對成纖維細胞活性及功能的影響;阻斷NF-κB信號通路后對骨髓間充質(zhì)干細胞參與糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合作用的影響,趨化因子SDF-1-α水平對骨髓間充質(zhì)干細胞功能、遷移和創(chuàng)面愈合的影響;探索其相關(guān)性,揭示間充質(zhì)干細胞參與糖尿病創(chuàng)面愈合的影響因素和可能機制,為慢性創(chuàng)面治療提供新的靶點和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、用TNF-α刺激體外培養(yǎng)的成纖維細胞,研究TNF-α激活NF

5、-κB途徑對成纖維細胞的增殖和細胞周期影響,同時檢測SDF-1α的變化。
　　2、采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病小鼠建立全層皮膚缺損的創(chuàng)面模型。分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)。實驗動物分為4組:①NC組:正常對照組;②DC組:糖尿病對照組;③MSC1組:糖尿病注射MSC;④MSC2組:糖尿病注射MSC,同時腹腔注射PDTC。在創(chuàng)緣注射移植MSCs,全程觀察創(chuàng)面愈合情況;然后分別在術(shù)后第3、7、11、14天切取創(chuàng)面組織

6、,進行組織染色,觀察創(chuàng)面中膠原生成、NF-κB、VEGF表達等指標。同時檢測創(chuàng)面組織中SDF-1α的變化。
　　結(jié)果：
　　1、TNF-α能夠影響培養(yǎng)成纖維細胞的增殖和細胞周期。TNF-α作用下成纖維細胞SDF-1α分泌水平呈現(xiàn)降低趨勢,而阻斷NF-κB信號則能促進SDF-1α分泌。
　　2、PDTC通過阻止IκB亞單位的降解,抑制NF-κB活化,從而阻斷NF-κB信號通路的激活。
　　3、小鼠腹腔注射STZ誘導(dǎo)

7、糖尿病,皮膚創(chuàng)傷后成功建立延遲愈合的糖尿病小鼠創(chuàng)面模型。
　　4、跟蹤觀察發(fā)現(xiàn),注射PDTC的干細胞治療組愈合率與正常小鼠一致,優(yōu)于糖尿病對照組和干細胞治療組(P<0.05)。
　　5、實驗小鼠創(chuàng)面組織HE和Masson染色可見,阻斷NF-κB信號通路可減少糖尿病小鼠創(chuàng)面炎性細胞浸潤時間,促使創(chuàng)面的肉芽組織、成纖維細胞和新生血管生成,同時膠原生成增多。
　　6、阻斷NF-κB信號通路能夠有效增加創(chuàng)面愈合過程中VEGF表

8、達和SDF-1α水平。
　　7、GFP熒光示蹤發(fā)現(xiàn),注射PDTC之后,創(chuàng)面內(nèi)移植骨髓間充質(zhì)干細胞GFP陽性細胞數(shù)及IOD值明顯大于對照組(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、一定濃度范圍的TNF-α具有促進成纖維細胞增殖能力的作用,通過阻斷NF-κB信號通路后,TNF-α的促增殖作用受到抑制。
　　2、PDTC阻止IκB亞單位的降解,抑制NF-κB活化,同時也阻礙NF-κB向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移,從而阻斷NF-κB信

9、號通路的激活。
　　3、TNF-α作用下成纖維細胞SDF-1α分泌呈現(xiàn)降低趨勢,而阻斷NF-κB信號則能促進SDF-1α分泌。TNF-α的作用與其濃度呈負相關(guān)。
　　4、在糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面邊緣注射移植MSCs,對創(chuàng)面愈合有明顯的促進作用,而阻斷TNF-α/NF-κB信號通路可以使這一作用增強,同時能夠改善創(chuàng)面微環(huán)境,減少炎性細胞浸潤時間及過度炎癥反應(yīng),促使創(chuàng)面的成纖維細胞增殖、肉芽組織和新生血管生成、膠原生成增多,最終加速