白芷呋喃香豆素的體內外處置以及基于CYP酶的藥物相互作用研究.pdf

1、中藥是中華醫(yī)學的瑰寶，并逐漸受到全世界的關注和重視。隨著中藥的應用日益廣泛以及多樣化，中藥與西藥合用的不良或毒性反應有較多報道，中藥與西藥合用時發(fā)生的代謝性相互作用，是產生不良或毒性反應的原因之一。相較于化學藥物，中藥的活性成分復雜、活性成分在體內的代謝處置性質不清楚、以及活性成分與代謝酶或轉運體的作用機制缺乏系統(tǒng)評價等因素，是中藥-西藥相互作用（herb-drug interaction,HDI）研究的難點。因此，系統(tǒng)研究中藥活性成分

2、的體內外代謝處置性質、與代謝酶或轉運體的作用及其機制，有助于全面認識中藥藥效與毒效的物質基礎，理解中藥多成分的配伍規(guī)律、以及藥物合用發(fā)生相互作用的機制，對于臨床安全有效用藥和中藥的現代化，具有重要意義。本課題以中藥白芷為研究對象，通過評價9個白芷呋喃香豆素的體內外代謝處置性質、及其與細胞色素P450（cytochrome,CYP）酶的抑制或誘導作用，研究白芷呋喃香豆素基于代謝酶的藥物相互作用及機制；并通過本課題的研究，探討中藥復雜成分H

3、DI的研究策略和方法。
　　白芷是應用廣泛的傳統(tǒng)中藥，也是多個經典方劑的重要組分。呋喃香豆素是白芷中的一大類活性成分，具有廣泛的藥理活性，在肝臟發(fā)生由CYP酶介導的廣泛代謝。已有的研究表明，白芷與處方藥物合用時，有發(fā)生HDI的風險，呋喃香豆素對CYP酶的抑制或誘導作用可能是白芷發(fā)生HDI的主要原因。但目前對白芷呋喃香豆素的體內外代謝處置性質及其與CYP酶相互作用的研究尚不系統(tǒng)，已有的研究多集中于歐前胡素等少數主要成分。為此，本課題

4、旨在通過白芷呋喃香豆素吸收、分布、排泄和藥代動力學過程的系統(tǒng)研究，闡明其體內外代謝處置特征，識別白芷給藥后體內血循環(huán)和組織器官中的標志性呋喃香豆素成分。在此基礎上，評價白芷呋喃香豆素對CYP酶的抑制或誘導作用，理解體內外代謝處置性質與藥物相互作用的關系，深入研究CYP酶抑制作用機制，為白芷的臨床合理用藥和人體HDI預測，提供必要的數據支持和科學依據。同時，在本研究的實施過程中，摸索并探討中藥多組分藥物相互作用研究的策略與方法。
　

5、　本課題的研究內容和結果總結如下：
　　1.建立并驗證了同時定量檢測生物樣品中歐前胡素（IM）、異歐前胡素（IIM）、水合氧化前胡素（OXYH）、佛手柑內酯（BER）、氧化前胡素（OXY）、花椒毒酚（XANT）、花椒毒素（XAN）、異茴芹內酯（IPIM）、補骨脂素（PSO）等9個呋喃香豆素的LC-MS/MS分析方法，方法靈敏、快速、可靠，可滿足白芷呋喃香豆素體內外代謝處置的研究需求。
　　2.大鼠口服白芷浸膏的血漿藥代動力學

6、結果顯示，白芷呋喃香豆素在大鼠的吸收和消除均較快，藥材中含量較高的IM、IIM、OXYH和BER是大鼠血循環(huán)中的主要活性成分，代表了白芷呋喃香豆素90％以上的體內暴露量，是血漿暴露的標志性成分。排泄動力學結果顯示，IM、IIM、BER、XAN、IPIM和 PSO的原型在尿、糞和膽汁中的回收率低于3%，表明其在體內發(fā)生廣泛代謝，主要以產物的形式排泄。
　　3.大鼠口服白芷浸膏后，呋喃香豆素在各組織中廣泛分布；IM、IIM、BER和O

7、XYH是血漿和組織中的主要活性成分，占到總呋喃香豆素暴露量的90%以上，由此確認它們是白芷呋喃香豆素的體內暴露標志物。呋喃香豆素的肝臟分布顯著高于血漿和其他組織，IM、IIM和 BER的肝臟和血漿暴露比值（Kp）分別為5.1、6.7和4.7，OXYH的Kp值為2.2。蛋白結合實驗表明，IM、IIM、BER和OXYH具有較高的血漿和組織蛋白結合率，其組織結合率高于血漿；經游離分數（u）校正后，與組織總Kp值相比，組織和血漿的游離暴露比值（

8、Kp,u）顯著降低，表明較高的蛋白結合是上述成分在組織高暴露的原因之一；IM、IIM和BER的游離肝臟/血漿比值Kp,u>2.6，表明它們可特異性地分布于肝臟。
　　4.采用懸浮培養(yǎng)的大鼠原代肝細胞模型，進一步探討了IM、IIM、BER和OXYH在肝臟高水平分布的機制。實驗表明，這些成分的肝細胞攝取是溫度依賴的，37℃的攝取量顯著高于4℃，提示它們的肝攝取可能存在主動轉運機制；攝取動力學結果顯示，IM、IIM、BER和OXYH的肝

9、細胞攝取同時涉及主動轉運和被動擴散，其中IM、IIM和BER以主動轉運為主，主動攝取率(CLactive/CLuptake）高于70%；將呋喃香豆素在大鼠原代肝細胞中與攝取轉運體的陽性抑制劑共孵育，攝取轉運體Oatp的抑制劑可顯著降低IM和BER的肝細胞攝取，轉運體Oat的抑制劑能明顯抑制IIM的肝攝取，表明攝取轉運體Oatp和Oat可能介導了IM、IIM和BER的主動轉運過程，并在其肝臟特異性分布中發(fā)揮作用。
　　5.給大鼠同時

10、服用白芷和CYP1A2探針底物非那西丁，通過檢測CYP1A2介導的非那西丁-O-脫乙基化反應，觀察到單次口服白芷可顯著提高非那西丁在大鼠的血漿暴露，白芷低劑量組（0.46 g/kg）和高劑量組（2.3 g/kg）的非那西丁血漿AUC分別為對照組血漿AUC的9和12倍，藥物清除率下降，T1/2和MRT0-t延長；代謝產物對乙酰氨基酚的生成受到抑制，Cmax降低至對照組的14%-22%，達峰時間顯著延遲，T1/2和MRT0-t延長；結果表明

11、白芷單次給藥可顯著抑制大鼠CYP1A2酶的活性。
　　6.采用混合探針底物法，評價9個白芷呋喃香豆素成分對人肝微粒體（HLM）和大鼠肝微粒體（RLM）主要 CYP酶活性的抑制作用。結果表明，呋喃香豆素成分對HLM和RLM中多個CYP酶均有不同程度的抑制作用，其中對CYP1A2的抑制作用最強；IM、IIM、BER、OXY、XAN、IPIM和 PSO是人 CYP1A2的強抑制劑，IC50值在0.023-0.25μmol/L之間；OXY

12、H和XANT是中等抑制劑。進一步比較白芷提取液和9個呋喃香豆素混合溶液的CYP酶抑制作用，發(fā)現所測的9個呋喃香豆素成分可基本上代表中藥白芷的CYP1A2抑制作用。由各呋喃香豆素單體在混合溶液中的含量分數和酶抑制IC50值，計算得到9個呋喃香豆素抑制CYP同工酶的整合IC50值；當CYP酶抑制作用分級為強或中等時，單體的整合IC50值與混合溶液的實測值相當，提示整合IC50值的方法可用于評價中藥多組分的酶抑制作用。由酶抑制IC50值和大鼠

13、肝臟濃度預測藥物相互作用風險，IM、IIM和BER對大鼠CYP1A2的[I]/Ki值分別為19.6、4.02和2.0，提示它們在與CYP1A2底物藥物合用時，具有較高的CYP1A2抑制相互作用風險，與大鼠體內實驗結果相符。種屬差異比較可見，IM、IIM、OXYH和BER對人CYP1A2的抑制作用強于大鼠，提示它們在人體具有CYP1A2酶抑制相互作用的高風險性。
　　7.應用IC50漂移實驗觀察到，IIM、OXYH和BER對HLM中

14、CYP1A2的抑制作用是時間依賴的，輔酶NADPH預孵組的抑制曲線明顯向左偏移，IC50比值(-/+)大于4；而IM的抑制作用是可逆性的?；跈C制的抑制動力學實驗進一步顯示，IIM、OXYH和BER對CYP1A2的抑制作用是預孵育時間和濃度依賴的，為基于機制的抑制（MBI），產生半數最大失活速率的濃度（KI）分別為2.08、1.96和6.71μmol/L，失活速率常數（kinact）分別為0.07、0.04和0.07 min-1，對CY

15、P1A2酶具有較強的滅活作用。
　　8.白芷浸膏多次給藥后，低劑量組和高劑量組使非那西丁的大鼠血漿暴露（AUC）分別下降45%和62%，清除率分別為對照組的1.76和2.65倍；代謝產物對乙酰氨基酚的達峰時間提前，高劑量組的Cmax增高，T1/2和MRT0-t縮短；表明白芷多次給藥可能通過CYP1A2酶誘導作用顯著加快非那西丁在大鼠體內的清除。
　　9.大鼠肝臟CYP酶活性和mRNA表達水平的測定結果顯示，白芷多次給藥后，對

16、大鼠肝臟CYP1A、CYP2B和CYP3A的酶活性和表達均有不同程度的誘導作用，其中，對CYP1A的誘導作用最強，并具有劑量依賴性；低劑量組和高劑量組CYP1A2的酶活性分別為對照組的1.9和2.2倍，CYP1A1的mRNA表達水平分別為對照組的8.4和43.5倍，CYP1A2的mRNA表達水平分別為對照組的2.7倍和16.8倍，顯示白芷多次給藥對大鼠CYP1A1的誘導作用強于CYP1A2。
　　10.應用SimCypTM軟件的P

17、BPK建模和模擬預測功能，構建了IM、IIM、OXYH和 BER的大鼠 PBPK模型，并采用大鼠實測數據對模型進行校正和驗證；在此基礎上建立了上述成分的人體PBPK模型，預測了人體血漿藥代動力學和藥物相互作用潛能。IM、IIM和 BER可使健康人群的咖啡因、非那西丁和茶堿AUC分別提高至對照組的2.0、1.7和1.3倍，在嚴重吸煙人群中合用組和對照組的AUC比值略高于健康人群相應的AUC比值，表明白芷呋喃香豆素在健康人群和吸煙人群均有發(fā)

18、生基于CYP1A2抑制的藥物相互作用風險。
　　本論文有如下的新發(fā)現或創(chuàng)新點：
　　1.白芷藥材中含量較高的IM、IIM、OXYH和BER也是血漿和組織中的主要活性成分，可作為白芷呋喃香豆素的體內暴露標志物，用于藥效與毒效評價，這一發(fā)現為白芷藥理學和藥物相互作用的物質基礎研究，提供了重要的依據。
　　2.IM、IIM、OXYH和BER在大鼠肝臟的暴露水平顯著高于血漿和其他組織；通過蛋白結合、大鼠原代肝細胞攝取和Caco

19、-2跨膜轉運等研究，發(fā)現攝取轉運體Oatp和Oat介導的主動轉運在IM、IIM和BER的肝臟特異性分布中發(fā)揮重要作用，非特異性蛋白結合也是這些成分在肝臟高暴露的原因之一。
　　3.給大鼠同服白芷和非那西丁的相互作用研究，揭示了白芷對CYP1A2酶的雙向調控作用，白芷單次給藥可強烈抑制大鼠CYP1A2酶，多次給藥不僅逆轉了單次給藥的抑制作用，還可顯著誘導CYP1A2的基因表達和酶活性，這一發(fā)現對白芷的臨床合理用藥具有重要的指導意義。

20、
　　4.建立并驗證了整合IC50值的酶抑制活性評價方法，可用于中藥多成分（強或中等抑制劑）酶抑制作用的整體評估，為多組分藥物的相互作用研究提供了可行的體外評價方法，也為中藥在人體的酶抑制相互作用預測提供了參考。
　　5.IM是人CYP1A2的可逆性抑制劑，IIM、OXYH和BER是CYP1A2基于機制的抑制劑，應用PBPK模型進行的人體預測顯示，這些成分在臨床與CYP1A2的底物藥物合用時，存在一定的藥物相互作用風險；預測