嗜線蟲致病桿菌Xnpt毒素酶解特性的研究.pdf

1、嗜線蟲致病桿菌Xenorhabdus nematophila HB310(Xn HB310)是與小卷蛾斯氏線蟲(Steinernema carpocapsae)共生的細(xì)菌,分離自河北省土壤中。該菌對多種農(nóng)業(yè)害蟲具有廣譜的殺蟲活性或抑制生長發(fā)育的作用,其殺蟲活性組份為蛋白復(fù)合物(簡稱Xnpt毒素)。前期實驗通過制備型非變性凝膠電泳對胞內(nèi)殺蟲蛋白進(jìn)行了分離和純化,得到了具有胃毒殺蟲活性的兩種蛋白毒素復(fù)合物(Xnpt1和Xnpt2),Xnpt

2、1蛋白毒素復(fù)合物主要由XptA1、XptB1和XptC1三種蛋白組成,對菜青蟲(Pieris rapae)具有較強(qiáng)的殺蟲活性,而Xnpt2蛋白毒素復(fù)合物主要由XptA2、XptB1和XptC1組成,對小菜蛾(Plutella xylostella)和棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)具有較強(qiáng)的殺蟲活性。為了探索嗜線蟲致病桿菌Xnpt毒素的殺蟲機(jī)理,本文研究了Xnpt毒素在昆蟲中腸內(nèi)的酶解特性,同時對酶解產(chǎn)物進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定

3、分析。另外,在實驗室條件下對嗜線蟲致病桿菌與蘇云金芽胞桿菌桿菌Bacillus thiningiensis(Bt)的交互抗性以及協(xié)同增效作用進(jìn)行了初步研究。主要結(jié)果如下:
　　 1.SDS-PAGE分析顯示,菜青蟲、棉鈴蟲、粘蟲(Mythimna separate)、美國白蛾(hyphantria cunea)以及斜紋夜蛾(Prodenia litura)幼蟲中腸液均能離體酶解Xnpt毒素(Xnpt1與Xnpt2混合物)和Xnp

4、t2毒素,其24h酶解效果無顯著差異,酶解后均出現(xiàn)了113kDa與60kDa的新蛋白條帶。市售胰蛋白酶同樣能酶解Xnp1及Xnpt2毒素,并且酶解產(chǎn)物中也出現(xiàn)了約113kDa與60kDa的新蛋白條帶,而市售胃蛋白酶、蛋白酶K對Xnpt和Xnpt2均無酶解作用。這些結(jié)果初步說明不同敏感性昆蟲中腸酶液中對Xnpt2及Xnpt起酶解作用的蛋白酶可能是胰蛋白酶。對113kDa與60kDa的酶解蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果表明,113kDa與60k

5、Da的酶解蛋白條帶與Xnpt2中的XptA2蛋白高度匹配,故推測這兩個酶解片段均為XptA2蛋白的酶解產(chǎn)物。
　　 2.以小菜蛾和棉鈴蟲幼蟲為試蟲,測定了Xnpt毒素經(jīng)不同昆蟲中腸酶液和蛋白酶處理24h前后的殺蟲活性的變化,發(fā)現(xiàn)酶解后的Xnpt毒素仍保持原有的殺蟲活性,推測XptA2蛋白在昆蟲中腸內(nèi)有與Bt Cry蛋白毒素類似的酶解過程,可能XptA2蛋白作為無活性的原毒素需要被昆蟲中腸內(nèi)的胰蛋白酶降解成更小的有活性毒素。

6、>　　 3.用Bt HD-73對小菜蛾敏感品系(DBM-S)在室內(nèi)進(jìn)行抗性篩選,獲得了抗性指數(shù)為105.43的抗性種群(DBM-R),該抗性種群對Bt HD-1也具有一定的抗性,抗性指數(shù)為30.70。在此基礎(chǔ)上測定了嗜線蟲致病桿菌HB310菌液對小菜蛾敏感種群和抗性種群的殺蟲毒力,結(jié)果表明,Xn HB310菌液對抗性種群小菜蛾的抗性指標(biāo)為0.92,表明Xn:HB310與Bt HD-73之間沒有交互抗性。增效作用測定結(jié)果表明,BtHD-