嗜線蟲致病桿菌HB310菌株pirA和pirB基因的克隆表達及特性的研究.pdf

1、嗜線蟲致病桿菌HB310菌株(Xenorhabdus nematophila HB310，Xn HB310)是本實驗室從小卷蛾斯氏線蟲中分離得到的一種具有廣譜殺蟲和抑菌活性的昆蟲病原線蟲共生細菌。本研究利用非變性凝膠電泳native-PAGE切膠回收方法從Xn HB310胞內總蛋白中通分離得到了一種對大蠟螟具有血腔注射活性的PirB蛋白，經室內測定該蛋白對5齡大蠟螟幼蟲血腔注射毒力LD50為13.92ng/頭。
　　在X.nema

2、tophila基因組序列的pirB基因附近我們也發(fā)現(xiàn)了pirA基因，為了深入的了解pirB基因的特性以及它和pirA基因之間的關系，我們根據質譜鑒定結果和GenBank上已登錄的X.nematophila ATCC19061基因組信息設計引物克隆了XnHB310中pirA和pirB基因，分別構建了克隆載體pMD18-T-pirA和pMD18-T-pirB，通過基因測序獲得pirA和pirB全長基因序列。對測序得到基因序列進行生物信息學分

3、析顯示，pirA基因完整開放閱讀框全長408bp，編碼135個氨基酸，PirA蛋白理論分子量為14.9kDa，等電點為5.0，為水溶性蛋白，該蛋白不含信號肽和跨膜結構域，PirA蛋白有82.6％的概率定位于細胞核;pirB基因完整開放閱讀框全長1290bp，編碼429個氨基酸，蛋白質理論分子量為48.2kDa，等電點為5.0，為水溶性蛋白，該蛋白存在跨膜結構，但是不含信號肽，含有類似Bt Endotoxin內毒素結構域和Jacalin_

4、like凝集素結構域，PirB蛋白有69.6％的概率定位于細胞核，21.7％的概率定位于線粒體，8.7％的概率定位于細胞質。二級結構預測顯示PirA蛋白不含有α螺旋，含有12個β折疊;PirB蛋白含有8個α螺旋和12個β折疊。最后通過同源建模在線軟件構建了PirA和PirB蛋白的三級結構模型。
　　為明確PirA和PirB蛋白的生物活性以及這兩個蛋白之間的關系，分別構建了pET28a-pirA和pET28a-pirB原核表達載體，

5、并且將pirA和pirB基因通過柔性接頭(GSGSGSGS)連在一起構建了pET28a-pirAB原核表達載體，轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)，經IPTG誘導表達得到了17kDa的重組蛋白PirA、48 kDa的重組蛋白PirB和64 kDa的重組融合蛋白PirAB-fusion。利用親和層析技術對表達的三種重組蛋白進行了純化，將純化的重組蛋白對5齡大蠟螟進行血腔活性測定，結果表明單獨表達的重組PirA和PirB蛋白以及Pir