小菜蛾RNAi通路核心元件的基因組篩選及PxDcr--2基因的功能驗證.pdf

1、RNA干擾（RNA interference，RANi）是由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引發(fā)，使得mRNA降解或翻譯被抑制的現(xiàn)象，在真核生物中高度保守。根據(jù)生物學(xué)機(jī)制和所結(jié)合Argonaute（Ago）蛋白的不同，RNAi在生物體內(nèi)存在三條通路：小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、小RNA（microRNA，miRNA）和PIWI互作RNA（PIWI-interac

2、ting RNA，piRNA）。雖然RNAi通路的核心元件在大多數(shù)生物中是保守的，但昆蟲中它們的保守程度卻不盡相同。而小菜蛾是目前全球分布的重要十字花科害蟲，在蟲體中能夠?qū)崿F(xiàn)RNAi。因此，我們利用小菜蛾基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，依據(jù)秀麗隱桿線蟲、果蠅、赤擬谷盜和家蠶的相關(guān)信息，篩選出RNAi通路中的核心元件。本研究中，在小菜蛾中發(fā)現(xiàn)2個Dicer基因、1個Drosha、基因5個Argonaute基因、1個Pasha基因和1個Loquacio

3、us基因，但并沒有發(fā)現(xiàn)R2D2基因。并且對這些基因在小菜蛾中不同發(fā)育階段和組織中的表達(dá)模式通過qPCR進(jìn)行了分析。
　　作為RNAi通路中的核心元件，Dicer-1蛋白主要在miRNA通路中發(fā)揮作用，Dicer-2蛋白則是siRNA形成中至關(guān)重要的。本研究中，對小菜蛾Dicer-1（PxDcr-1）基因CDS的全長和小菜蛾Dicer-2（PxDcr-2）基因CDS的全長首次進(jìn)行了克隆和分析，并且通過 RNAi實驗對 PxDcr-2

4、基因的功能進(jìn)行了初步探索。PxDcr-1基因的CDS全長為8457 bp，氨基酸序列長度為2818 aa；PxDcr-2基因的CDS全長為5,091 bp，氨基酸序列長度為1,696 aa。通過氨基酸序列比對和進(jìn)化樹分析，PxDcr-1和PxDcr-2蛋白都與鱗翅目昆蟲同源性最高，特別是黑脈金斑蝶。在RNAi干擾的實驗中，dsDcr-2-2對PxDcr-2的mRNA表達(dá)量的抑制效果最佳，但在注射dsRNA后，在生長發(fā)育過程中沒有明顯的表