B9601-Y2菌株的基因組解析及部分功能驗(yàn)證.pdf

1、植物促生根圍細(xì)菌是一類生活于植物根圍土壤，并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的一類細(xì)菌，是農(nóng)業(yè)生物防治的重要組成部分。B9601-Y2（以下簡(jiǎn)稱Y2）是實(shí)驗(yàn)室從小麥根際土壤中分離并保存的一株解淀粉芽孢桿菌，隸屬于植生亞種。離體條件下，Y2對(duì)多種植物病原真菌和細(xì)菌具有很強(qiáng)的拮抗活性;在大田試驗(yàn)中，能促進(jìn)多種農(nóng)作物的生長(zhǎng)和增產(chǎn)。為了研究其促生防病機(jī)制，本研究對(duì)該菌株的全基因組進(jìn)行了測(cè)序和解析，并以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assiste

2、dlaserdesorption/ionization-timeofflight-massspectrometry,MALDI-TOF-MS)證實(shí)其分泌抗生素類物質(zhì);構(gòu)建了綠色熒光(greenfluorescentprotein，GFP)表達(dá)載體，研究其在玉米根際土壤及玉米體內(nèi)定殖動(dòng)態(tài);通過(guò)基因工程方法，恢復(fù)了該菌株形成自然感受態(tài)的能力。取得了如下研究結(jié)果:
　　1.Y2的基因組大小為4238624bp，GC含量占45.76％，在

3、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)為NC_17912.1，它含有4159個(gè)CDS，編碼區(qū)總長(zhǎng)度為3704557bp，約占全基因組的87.4％;它共有91個(gè)tRNA基因、10個(gè)rDNA拷貝、69個(gè)串聯(lián)重復(fù)區(qū)域、73個(gè)轉(zhuǎn)座子和24個(gè)插入序列元件。
　　2.通過(guò)基因組注釋，發(fā)現(xiàn)Y2具有多種生存策略，能夠忍受極端的環(huán)境條件。它含有芽孢桿菌DNA損傷修復(fù)的保守核心基因，如切除修復(fù)系統(tǒng)所需的alkA(MUS_4255)、ung(MUS_4184)、mu

4、tM(MUS_3183)等基因成員;錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)mutS(MUS_1860)、mutL(MUS_1861)、XseA(MUS_2727)以及XseB(MUS_2726);非同源末端接合以及同源修復(fù)系統(tǒng)所需的關(guān)鍵基因等。Y2含有利用纖維素、半纖維素、果膠以及淀粉類的基因成員，如MUS_2161、ydhP(MUS_4265)、bglS(MUS_4304)、pelB(MUS_4319)以及amyE(MUS_0286)等，能夠降解利用土壤中有限

5、的大分子物質(zhì)并快速壯大自己種群數(shù)量;同時(shí)還存有包括脫乙酰幾丁質(zhì)酶csn(MUS_3567)等在內(nèi)的編碼基因降解幾丁質(zhì)。Y2擁有與植物寄主相容全套基因簇和調(diào)控元件。
　　3.Y2基因組中含有多種抗生素的合成基因簇，MALDI-TOF-MS也證實(shí)Y2除了分泌如芬薺素、伊枯草菌素、嗜鐵素、溶桿菌素、桿菌烯、大環(huán)內(nèi)酯以及地非西丁在內(nèi)的一些脂肽類和聚酮類抗生物質(zhì)外，還能合成羊毛硫抗生素化合物摩薩西丁，拮抗多種植物病原菌，減少植物病害的發(fā)生。

6、基因組中還有殺線蟲(chóng)相關(guān)的堿性絲氨酸蛋白酶基因及促生長(zhǎng)化合物2，3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮、生長(zhǎng)素(IAA)的合成代謝途徑，從而為Y2菌株促生長(zhǎng)、防治真菌性病害和根結(jié)線蟲(chóng)病害提供了分子依據(jù)。
　　4.Y2缺失表面活性素的合成基因簇srfA的第二個(gè)成員srfAB，導(dǎo)致不能合成表面活性素(surfactin)。srfAB缺失的間接后果導(dǎo)致了與感受態(tài)形成相關(guān)的必需基因comS丟失，致使Y2不能形成自然感受態(tài)。comS的上游調(diào)控基因co

7、mX也發(fā)生了缺失現(xiàn)象。Y2具有編碼Ⅰ型限制修復(fù)系統(tǒng)的基因簇hsdRMS(MUS_3105～MUS_3103)，導(dǎo)致Y2的后續(xù)分子操作困難。
　　5.以芽孢桿菌表達(dá)載體pHT01為載體骨架，構(gòu)建了不同類型的大腸桿菌-芽孢桿菌GFP表達(dá)穿梭載體。通過(guò)自然轉(zhuǎn)化，將5種GFP表達(dá)載體導(dǎo)入“保姆”菌株枯草芽孢桿菌168和解淀粉芽孢桿菌FZB42，提取質(zhì)粒并電擊轉(zhuǎn)化Y2感受態(tài)細(xì)胞，成功地獲得了3株穩(wěn)定性好、具GFP標(biāo)記的Y2菌株，分別命名為Y

8、2-pHAPII、Y2-pGFP4412以及Y2-P43GFPmut3a。
　　6.選用GFP標(biāo)記菌Y2-P43GFPmut3a為接種材料，初步研究了Y2在玉米根系及根際土壤的定殖動(dòng)態(tài)和內(nèi)生性。Y2在玉米的根內(nèi)、根表及根際土壤有良好的定殖，在接近2個(gè)月的期間內(nèi)，菌澆數(shù)量分別維持在103～104、106～107以及105～106cfu/g(鮮根或土)，種群數(shù)量變化不大。Y2也能在玉米的莖、葉組織中定殖，定殖密度為102cfu/g鮮組

9、織。利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察組織壓片和切片，證明在接種2天后，Y2就在玉米根毛、根的伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)定殖，接種第5天和第9天，就能在玉米莖和葉組織中找到定殖菌體。組織觀察與菌落回收的結(jié)果相吻合。
　　7.以pHT01為出發(fā)載體，構(gòu)建了誘導(dǎo)表達(dá)感受態(tài)形成關(guān)鍵因子ComK的載體pHT01-comK并導(dǎo)入Y2感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)ComK，Y2的自然感受特性得到了恢復(fù)。當(dāng)以解淀粉芽孢桿菌自然轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)培養(yǎng)基GCHE培養(yǎng)Y2至OD600