固有免疫分泌性蛋白SPLUNC1的鑒定及其參與鼻咽癌細(xì)胞凋亡與分化的作用機(jī)制研究.pdf

1、【SPLUNC1的克隆及前期研究成果】為尋找在鼻咽組織中特異性表達(dá)的鼻咽癌相關(guān)基因，我所張必成博士等通過(guò)抑制性消減雜交聯(lián)合cDNA微陣列技術(shù)，克隆了鼻咽組織相關(guān)的特異性表達(dá)基因(nasopharynixassociatedspecificgene，NASG)。后來(lái)國(guó)外的多個(gè)研究所通過(guò)二維電泳及基因芯片篩查分離出該基因，由于它與小鼠的上腭、肺及鼻咽上皮克隆(Palate，LungandNasalepitheliumClone，PLUNC)

2、基因高度同源，在豬、牛、大鼠等物種中都高度保守，分子量小，因而被統(tǒng)一命名為短的PLUNC(ShortPLUNC1，SPLUNC1)基因1。前期的研究發(fā)現(xiàn)，SPLUNC1可能在成人的上呼吸道中特異性表達(dá)，而且在鼻咽癌細(xì)胞株及組織活檢標(biāo)本中表達(dá)下調(diào)。我所姚開(kāi)泰院士領(lǐng)導(dǎo)的課題小組對(duì)SPLUNC1基因的多態(tài)性與鼻咽癌的易感性之間的關(guān)系研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，SPLUNC1是一個(gè)鼻咽癌發(fā)生的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。然而，SPLUNC1的功能及具體的作用機(jī)制并不清楚

3、，雖然國(guó)內(nèi)外的學(xué)者一致推測(cè)SPLUNC1可能參與上呼吸道的固有免疫反應(yīng)，但這些推測(cè)均是基于SPLUNC1的細(xì)胞與組織定位而做出的功能假設(shè)。然而，在沒(méi)有對(duì)其做出精確的組織定位前，所有功能假設(shè)有可能并不成立。因而對(duì)SPLUNC1的精細(xì)組織定位顯得非常迫切。 【通過(guò)制備SPLUNC1高特異性抗體，對(duì)其進(jìn)行精確的組織學(xué)定位并鑒定它為一種分泌性蛋白】要對(duì)SPLUNC1蛋白做出精細(xì)的組織學(xué)定位，首要的是必須制備SPLUNC1的抗體。因此我

4、們通過(guò)對(duì)SPLUNC1的結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)，設(shè)計(jì)并制備了SPLUNC1的高特異性多肽抗體，驗(yàn)證了該抗體能用于免疫組化和westernblot研究。同時(shí)，通過(guò)免疫組化對(duì)人體42種組織的精細(xì)定位研究發(fā)現(xiàn)，SPLUNC1分布于上呼吸道，眼睛、胃及小腸等與外界環(huán)境及有害物質(zhì)直接接觸的部位，表達(dá)于這些部位的上皮及粘膜下腺體，在上皮細(xì)胞的頂端(頂漿分泌)、漿液腺與瞼結(jié)膜的瞼板腺以及腺導(dǎo)管內(nèi)表達(dá)量最高，暗示著SPLUNC1能分泌到這些與外界環(huán)境及有害物質(zhì)

5、直接接觸的上皮表面。為此，我們收集了志愿者的眼淚和唾液，以及門(mén)診體檢者的鼻咽分泌物，將它們通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳后進(jìn)行westernblot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這些體液中確實(shí)存在SPLUNC1蛋白的分泌。并預(yù)測(cè)SPLUNC1是覆蓋在上皮表面的一種天然免疫保護(hù)分子。 【通過(guò)研究SPLUNC1的抗菌與抗EBV，鑒定SPLUNC1蛋白為上皮表面的固有免疫保護(hù)分子，并初步證明它具有阻止EBV致瘤的作用】由于上皮表面的天然免疫保護(hù)分子

6、常常在對(duì)抗感染，清除有害微生物中發(fā)揮重要作用，我們進(jìn)一步研究了SPLUNCl對(duì)上呼吸道常見(jiàn)微生物的作用及其作用機(jī)理。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)與蛋白三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，SPLUNCl含有一段19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和一個(gè)殺菌/細(xì)菌滲透增強(qiáng)蛋白(bactericidal/bacteriapermeabilityincreasingprotein，BPI)結(jié)構(gòu)域，其三維結(jié)構(gòu)與細(xì)菌滲透增強(qiáng)蛋白及脂多糖結(jié)合蛋白相似，表明SPLUNCl可能具有結(jié)合細(xì)菌脂多糖(li

7、popolysaccharide，LPS)，殺滅或抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的功能。于是我們選取了上呼吸道常見(jiàn)的綠膿桿菌，用SPLUNCl對(duì)其進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)SPLUNCl蛋白能明顯抑制綠膿桿菌的生長(zhǎng)，并通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證了SPLUNCl與細(xì)菌脂多糖的結(jié)合。從而證明了SPLUNCl清除細(xì)菌的功能。 由于SPLUNCl在正常鼻咽上皮與腺體中高表達(dá)，在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)并與鼻咽癌的遺傳易感性相關(guān)，而目前公認(rèn)的唯一與鼻咽癌相關(guān)的致病微生物為EB病毒，

8、因此我們觀察了SPLUNCl對(duì)EBV的影響。我們發(fā)現(xiàn)SPLUNCl能明顯的促進(jìn)EBV感染細(xì)胞的凋亡與裂解，同時(shí)部分EBV自身也出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)破損。EBV編碼的瘤基因LMPl表達(dá)下降，而有利于EBV被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別的gp350表達(dá)則明顯增高，這一結(jié)果使我們將SPLUNCl的抗微生物作用與抑瘤作用有機(jī)的結(jié)合起來(lái)：當(dāng)機(jī)體SPLUNCl的表達(dá)正常時(shí)，即使存在EBV的感染，高表達(dá)的SPLUNCl也能促使感染細(xì)胞的裂解提前，一方面促使EB病毒裂解

9、，表達(dá)易被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別的gp350蛋白，從而啟動(dòng)補(bǔ)體途徑和ADCC作用，對(duì)EB病毒進(jìn)行清除；另一方面，SPLUNCl又抑制EB病毒表達(dá)LMPl，使其致瘤的能力降低。 【首次在鼻咽癌組織中發(fā)現(xiàn)了能引起細(xì)胞線粒體水腫的納米細(xì)菌，證明了SPLUNC1可通過(guò)其BPI結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)納米細(xì)菌結(jié)合，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了SPLUNC1蛋白為上皮表面的固有免疫保護(hù)分子】有趣的是，我們通過(guò)GFP介導(dǎo)的SPLUNC1亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，SPLUNC

10、1可與細(xì)胞內(nèi)一種未知的微生物結(jié)合，這種結(jié)合依賴(lài)于SPLUNC1蛋白的BPI結(jié)構(gòu)域，我們鑒定出該微生物為納米細(xì)菌，大小為50-400nm，并發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌可在鼻咽癌活檢標(biāo)本中存在，引起周?chē)木€粒體水腫；因而我們不但在鼻咽癌組織中發(fā)現(xiàn)了一種新的微生物——納米細(xì)菌，而且發(fā)現(xiàn)SPLUNC1能與該細(xì)菌結(jié)合，從而發(fā)揮固有免疫保護(hù)作用。 【SPLUNC1可通過(guò)TNFα受體與線粒體途徑促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，并參與了NFκB與MAPK途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)】

11、考慮到SPLUNC1可能是一種潛在的抑瘤基因，我們研究了它對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPLUNC1能明顯的抑制細(xì)胞的存活及腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化與凋亡。并且發(fā)現(xiàn)了SPLUNC1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的兩條主要途徑：一是通過(guò)增加NFκB的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α(TNFα)，再通過(guò)死亡受體途徑，增加Caspase8以及Caspase3的表達(dá)，最后導(dǎo)致DNA的斷裂與細(xì)胞凋亡；二是通過(guò)抑制Bcl-2基因的表達(dá)與促進(jìn)Bax

12、的表達(dá)，增加Bax與Bcl-2的比率，抑制Bad分子的磷酸化，從而啟動(dòng)線粒體凋亡途徑。 而通過(guò)對(duì)SPLUNC1參與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究發(fā)現(xiàn)，SPLUNC1能調(diào)節(jié)ERK與JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而不調(diào)節(jié)P38MAPK信號(hào)通路；SPLUNC1可能通過(guò)促進(jìn)ERK的磷酸化而促進(jìn)細(xì)胞的分化，促進(jìn)JNK2的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。并且發(fā)現(xiàn)SPLUNC1與細(xì)菌脂多糖(LPS)均能增加HNE1細(xì)胞NFκB/P65的表達(dá)，而SPLUNC1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

13、對(duì)LPS刺激的HNE1細(xì)胞NFκB/P65表達(dá)無(wú)明顯影響，因而推測(cè)LPS對(duì)HNE1細(xì)胞NFκBP65表達(dá)的調(diào)控是由SPLUNC1介導(dǎo)的。 【SPLUNC1的表達(dá)與分泌隨鼻咽上皮的不典型增生與癌變迅速降低，因而可以作為早期診斷與患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的指標(biāo)】眾所周知，作為一種天然免疫防御分子，應(yīng)該是在疾病發(fā)生的早期起作用。因此我們利用高通量的組織芯片和免疫組化技術(shù)研究了SPLUNC1在鼻咽組織分化各階段的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在初診鼻咽癌的組織標(biāo)

14、本中，高達(dá)93.85％表達(dá)陰性；在輕度不典型增生的鼻咽上皮組織中，SPLUNC1就明顯表達(dá)下調(diào)，隨著鼻咽組織從輕度不典型增生向重度不典型增生演進(jìn)，SPLUNC1的表達(dá)也越來(lái)越低。同時(shí)，由于前面驗(yàn)證了SPLUNC1為分泌性蛋白，因此我們收集了鼻咽癌患者的鼻咽分泌物，且每個(gè)患者分別從正常側(cè)的鼻咽與患癌側(cè)的鼻咽取樣，分開(kāi)保存。經(jīng)過(guò)對(duì)45例初發(fā)鼻咽癌患者、3例放療后患者及13例正常人或鼻咽部慢性炎癥患者的雙側(cè)鼻咽分泌物中SPLUNC1蛋白表達(dá)量

15、的分析，我們發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者患癌側(cè)的鼻咽分泌物中SPLUNC1表達(dá)顯著降低，在部分患癌側(cè)的鼻咽分泌物中甚至不能通過(guò)westernblot檢測(cè)到SPLUNC1的信號(hào)。而在慢性炎癥患者或正常的鼻咽分泌中，有較高的SPLUNC1分泌。即使在鼻咽癌患者的正常未患癌側(cè)鼻咽，其分泌物中SPLUNC1的分泌量也明顯下降。這說(shuō)明在鼻咽癌患病的早早期，甚至鼻咽上皮還未出現(xiàn)不典型增生時(shí)，SPLUNC1的表達(dá)已出現(xiàn)明顯下調(diào)或缺失。從而說(shuō)明固有免疫保護(hù)分子SPL