過表達(dá)ANT1基因誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡與Bax-Bcl-2表達(dá)的關(guān)系研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 冠心病介入術(shù)后再狹窄發(fā)病率高，成為介入手術(shù)晚期失敗的主要原因。再狹窄的發(fā)生主要原因是新生內(nèi)膜形成和血管重塑，其中平滑肌細(xì)胞凋亡與增殖的失衡在新生內(nèi)膜形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。參與平滑肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子眾多，調(diào)節(jié)機(jī)制也存在多條途徑。主要有線粒體介導(dǎo)的信號(hào)通路，死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)通路等。線粒體是細(xì)胞能量代謝的中心，并且在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在細(xì)胞接受凋亡刺激后，引起線粒體膜通透性增高，線粒體膜

2、電位降低，繼而釋放凋亡相關(guān)蛋白，如細(xì)胞色素C(CytC)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等，釋放的CytC與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)結(jié)合，活化半胱氨酸蛋白水解酶(caspase) 9,進(jìn)而激活caspase 3 途徑，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶是定位于線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一,屬于物種進(jìn)化中的保守區(qū)域,是細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因[2]，研究表明ANT1誘導(dǎo)凋亡作用與線粒體滲透性轉(zhuǎn)換復(fù)合孔(mitochondri

3、Alpermeability transition pore MPTP)有關(guān)[3]，可能作為MPTP的一個(gè)必要成分，或是與MPTP的主要成分之一-----親環(huán)素D（Cyclophilin D)相互作用[4]，從而引起線粒體膜電位降低，觸發(fā)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)ANT1可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的凋亡，在體實(shí)驗(yàn)中可以減小腫瘤瘤體體積[5，6]。
　　 因而，本研究通過構(gòu)建ANT1腺病毒載體，分別用攜帶ANT1基因的GF

4、P 標(biāo)記的腺病毒及空載體腺病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞，檢測(cè)ANT1的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)過表達(dá)ANT1的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)及增殖活性檢測(cè)，并分別提取各組細(xì)胞的mRNA和蛋白，檢測(cè)其中Bax/Bcl-2的表達(dá)。從而評(píng)價(jià)其對(duì)平滑肌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及作用機(jī)制，以此為作用靶點(diǎn)，可能為支架術(shù)后再狹窄等有關(guān)平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡失衡疾病提供了新的治療途徑。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、構(gòu)建攜帶ANT1基因的GFP 標(biāo)記的重組腺病毒

5、表達(dá)載體。采用分子克隆技術(shù)，重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-CMV-ANT1和pShuttle-GFP-CMV，與pAdxSi載體酶切后連接，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293細(xì)胞，包裝產(chǎn)生ANT1腺病毒顆粒，RT-PCR 鑒定為ANT1重組復(fù)制缺陷腺病毒后進(jìn)行大量擴(kuò)增。
　　 2、組織塊法體外培養(yǎng)原代大鼠血管平滑肌細(xì)胞，用α-actin 進(jìn)行鑒定。以Ad-ANT1或Ad-GFP 病毒轉(zhuǎn)染VSMCs，觀察不同時(shí)間的轉(zhuǎn)染

6、效率。并通過RT-PCR及Western Blotting 方法檢測(cè)各組細(xì)胞ANT1mRNA及蛋白的表達(dá)水平。
　　 3、以Ad-ANT1或Ad-GFP 病毒轉(zhuǎn)染VSMCs，分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖：
　　 利用激光共聚焦觀察Hochest 染色凋亡細(xì)胞核，流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，激光共聚焦觀察TMRE 法檢測(cè)線粒體膜電位改變。細(xì)胞計(jì)數(shù)法及CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。
　　 4、轉(zhuǎn)染后分別

7、取各組細(xì)胞，利用RT-PCR及Western Blotting 方法檢測(cè)各組Bax/Bcl-2的mRNA及蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定，應(yīng)用組織塊法原代培養(yǎng)所得細(xì)胞即為VSMCs?？梢杂糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2、成功構(gòu)建并擴(kuò)增了Ad-ANT1和Ad-GFP(空載體對(duì)照)腺病毒，病毒滴度測(cè)定為2×1011pfu/ml。最佳感染復(fù)數(shù)MOI為80-100，分別

8、用ANT1腺病毒載體及空載體腺病毒轉(zhuǎn)染VSMCs后，轉(zhuǎn)染效率高約80-90％，RT-PCR及 Western Blotting 顯示于空載體轉(zhuǎn)染組相比較，前者ANT1mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著增高?？梢杂糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 3、細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：形態(tài)學(xué)檢測(cè)：激光共聚焦觀察Hoechst 染色后，Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞染色質(zhì)邊聚，細(xì)胞核不規(guī)則，固縮，或碎裂等明顯細(xì)胞凋亡表現(xiàn)。
　　 空載體組細(xì)胞核無(wú)顯著性改變。TMR

9、E 法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位，Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)線粒體膜電位下降或消失，空載體轉(zhuǎn)染組無(wú)顯著性改變。TUNEL及流式細(xì)胞術(shù)顯示Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡特征明顯，然后計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，與空載體轉(zhuǎn)染組相比較有顯著性差異。
　　 4、細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果：經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)及CCK8 法檢測(cè)，與空載體轉(zhuǎn)染組相比較，Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活性顯著降低。
　　 5、RT-PCR及 Western Blotting 檢測(cè)Ad-A

10、NT1轉(zhuǎn)染組Bax的mRNA及蛋白表達(dá)水平增高,與空載體轉(zhuǎn)染組相比較有顯著差異。Bcl-2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平兩組間無(wú)顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建了ANT1的腺病毒過表達(dá)載體，并且在體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中有效表達(dá)。
　　 2、過表達(dá)ANT1腺病毒組能明顯抑制細(xì)胞增殖活性，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。
　　 3、過表達(dá)ANT1腺病毒載體，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，是通過上調(diào)