斑塊來源血管平滑肌細(xì)胞中生物鐘基因、凋亡及纖溶系統(tǒng)基因表達(dá)改變的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化性疾病嚴(yán)重危害人類的健康，血管重塑和斑塊穩(wěn)定性轉(zhuǎn)變機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)和關(guān)注的中心。研究發(fā)現(xiàn)生物鐘基因與心血管系統(tǒng)的功能有密切關(guān)系。生物鐘是參與調(diào)控機(jī)體各項(xiàng)行為生理活動的系統(tǒng)，以近24小時為周期呈節(jié)律性振蕩。生物鐘系統(tǒng)包括中樞生物鐘系統(tǒng)和外周生物鐘系統(tǒng)。中樞生物鐘系統(tǒng)位于下丘腦的視交叉上核神經(jīng)元中，并通過神經(jīng)、體液等信號調(diào)控外周生物鐘系統(tǒng)。近年來的研究表明，外周組織和細(xì)胞同樣擁有一個和中樞相似的相對獨(dú)立的生物鐘系統(tǒng)。主要的生

2、物鐘基因包括:Bmal1，Clock，Per，Cry，Rev-erbα等，他們之間互相作用形成一個轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路，從而協(xié)調(diào)鐘基因及下游鐘控基因的節(jié)律性表達(dá)。
　　通過對鐘控基因的調(diào)控，生物鐘基因參與到一些心血管疾病高危因素的調(diào)節(jié)，如代謝紊亂、炎癥、凝血異常等。在多種心血管疾病過程中，研究均發(fā)現(xiàn)鐘基因的表達(dá)節(jié)律發(fā)生改變。這提示生物鐘基因及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能在斑塊形成及穩(wěn)定性轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮了重要作用。研究表明:鐘基因參與調(diào)控細(xì)

3、胞增殖和凋亡;鐘基因敲除小鼠易形成高脂血癥和肥胖綜合征;鐘基因敲除小鼠血管發(fā)生病理性重塑，血管老化，血管舒張反應(yīng)減弱，促炎因子表達(dá)增加，舒血管因子合成減少，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生;鐘基因突變小鼠體內(nèi)凝血功能發(fā)生改變，纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)和組織型纖溶酶原激活物(t-PA)表達(dá)幅度和節(jié)律均出現(xiàn)混亂，可導(dǎo)致動脈粥樣硬化血栓形成。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，apoE基因敲除的小鼠動脈粥樣硬化模型，心血管系統(tǒng)鐘基因(Per2、Bmal1)

4、表達(dá)節(jié)律發(fā)生改變。同時還發(fā)現(xiàn)，該小鼠的凋亡相關(guān)基因（c-myc和p53等）和纖溶系統(tǒng)相關(guān)基因（PAI-1和t-PA）的表達(dá)節(jié)律發(fā)生了混亂。但是，目前國內(nèi)外在此方面的研究主要集中于動物實(shí)驗(yàn)。
　　本課題在前期工作的基礎(chǔ)上，直接針對人類頸動脈粥樣硬化病變進(jìn)行研究。構(gòu)建了改良植塊法體外培養(yǎng)頸動脈斑塊來源及正常頸動脈來源的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)模型。對斑塊來源VSMCs的理化及形態(tài)學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了細(xì)致研究。同時，我們采用血清休克法誘導(dǎo)V

5、SMCs的晝夜節(jié)律，來觀察生物鐘基因的節(jié)律性表達(dá)情況，并探討生物鐘基因在動脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展過程中起的作用。最后，我們還檢測了斑塊來源的VSMCs和正常頸動脈來源的VSMCs中，與斑塊穩(wěn)定性相關(guān)的凋亡相關(guān)基因和纖溶系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)節(jié)律，以期發(fā)現(xiàn)下游鐘控基因表達(dá)節(jié)律改變在斑塊易損性轉(zhuǎn)變過程中所起的作用。
　　第一部分:人頸動脈粥樣硬化斑塊來源血管平滑肌細(xì)胞中生物鐘基因表達(dá)的變化
　　目的:建立人頸動脈粥樣硬化斑塊來源的血

6、管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)模型，觀察頸動脈斑塊來源的血管平滑肌細(xì)胞模型的理化及形態(tài)學(xué)特性。檢測斑塊來源血管平滑肌細(xì)胞中生物鐘基因表達(dá)的改變，并探討其機(jī)制。
　　方法:采用改良植塊法體外培養(yǎng)頸動脈斑塊來源及正常頸動脈來源VSMCs模型。其中斑塊標(biāo)本源自2012年5月到2013年7月間在中山醫(yī)院血管外科行頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)的患者，共計56例。正常頸動脈標(biāo)本采集自心臟移植供體（健康志愿捐獻(xiàn)者）血管，共10例。采用倒置相差顯微鏡、免疫熒光染色、油

7、紅O染色及透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和理化特性。通過血清休克法誘導(dǎo)細(xì)胞生物鐘基因的節(jié)律性表達(dá)。將血清休克開始的時間定義為Zeitgeber time0(ZT0)，分別在ZT0，ZT4，ZT8，ZT12，ZT16和ZT20等6個時間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取RNA，采用Real-TimePCR檢測不同來源VSMCs中生物鐘基因(Bmal1，Clock，Cry1，Cry2，Per1，Per2，Per3和Rev-erbα)在mRNA水平表達(dá)量及表達(dá)節(jié)律

8、的變化。
　　結(jié)果:56例斑塊標(biāo)本中，21例成功培養(yǎng)出足夠的VSMCs。在10例正常對照中有7例培養(yǎng)出VSMCs。植塊7-12天后，細(xì)胞開始呈放射狀從植塊邊緣遷移出來，培養(yǎng)約4周后細(xì)胞形成典型的“峰-谷樣”結(jié)構(gòu)，可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。正常頸動脈來源的VSMCs為典型的長梭形，而斑塊來源的VSMCs分化為兩種差異較大的細(xì)胞形態(tài):長梭形和大而扁平的不規(guī)則星形，同時兩種形態(tài)的細(xì)胞均表達(dá)血管平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA。但是，油紅O染色結(jié)果發(fā)

9、現(xiàn):不規(guī)則星形細(xì)胞的脂質(zhì)含量要明顯高于長梭形細(xì)胞;同時，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)提示:長梭形細(xì)胞內(nèi)可見典型的肌絲結(jié)構(gòu)和致密體，而不規(guī)則星形細(xì)胞內(nèi)則含有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴空泡。據(jù)此推斷，斑塊來源的血管平滑肌細(xì)胞其表型發(fā)生了轉(zhuǎn)變，分化為兩種細(xì)胞表型:收縮型（長梭形細(xì)胞）和合成型（不規(guī)則星形細(xì)胞）。血清休克后，正常頸動脈來源VSMCs和斑塊來源VSMCs的生物鐘基因Bmal1，Cry1，Cry2，Per1，Per2，Per3，Rev-er

10、bα在mRNA水平均呈24h節(jié)律性表達(dá)，Clock mRNA在斑塊來源VSMCs中呈節(jié)律性表達(dá)而在正常頸動脈來源VSMCs無明顯節(jié)律性。但是，與正常頸動脈來源VSMCs相比，斑塊來源VSMCs的核心生物鐘基因振蕩幅度在mRNA水平顯著減弱;且BMAL1的24h節(jié)律性亦發(fā)生改變，峰值相位從ZT16前移到了ZT12。在校正了年齡因素后，對兩組細(xì)胞進(jìn)行亞組分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)果仍一致。
　　第二部分:斑塊來源血管平滑肌細(xì)胞中凋亡及纖溶系統(tǒng)相關(guān)基

11、因改變的研究
　　目的:檢測斑塊來源血管平滑肌細(xì)胞中凋亡及纖溶系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的改變，探索生物鐘基因調(diào)控下游鐘控基因的潛在通路，并探討其機(jī)制。
　　方法:通過血清休克法誘導(dǎo)細(xì)胞生物鐘基因的節(jié)律性表達(dá)。將血清休克開始的時間定義為Zeitgeber time0(ZT0)，分別在ZT0，ZT4，ZT8，ZT12，ZT16和ZT20等6個時間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取RNA，采用Real-Time PCR檢測不同來源VSMCs中凋亡相關(guān)基因（

12、Fas，p53和Bax）及纖溶系統(tǒng)相關(guān)基因（PAI-1和t-PA）等在mRNA水平表達(dá)量及表達(dá)節(jié)律的變化。
　　結(jié)果:血清休克后，正常頸動脈來源VSMCs中與斑塊穩(wěn)定性有關(guān)的凋亡相關(guān)基因（Fas和P53）和纖溶相關(guān)基因（PAI-1和t-PA）呈晝夜節(jié)律性表達(dá)，而在斑塊來源VSMCs中除t-PA外其余相關(guān)基因的表達(dá)節(jié)律均發(fā)生紊亂，失去了統(tǒng)一的節(jié)律性。且與正常頸動脈來源VSMCs相比，在斑塊來源VSMCs中PAI-1表達(dá)水平升高，而t

13、-PA振蕩幅度則減低且峰值相位前移至ZT12。
　　結(jié)論:采用改良植塊法體外培養(yǎng)頸動脈斑塊來源及正常頸動脈來源VSMCs模型。與正常頸動脈來源VSMCs相比，頸動脈斑塊來源VSMCs表型發(fā)生了轉(zhuǎn)變，分化為兩種細(xì)胞表型:收縮型和合成型。通過血清休克法誘導(dǎo)VSMCs生物鐘基因晝夜節(jié)律性表達(dá)模型。與正常頸動脈來源VSMCs相比，頸動脈斑塊來源VSMCs其核心生物鐘基因振蕩幅度明顯減弱，節(jié)律發(fā)生改變;其下游與斑塊穩(wěn)定性有關(guān)的凋亡和纖溶相關(guān)