不同年齡女性人體脂肪來源干細(xì)胞體外培養(yǎng)生長特點(diǎn)比較.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 觀察26至45歲之間不同年齡段人體脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)。于不同年齡人體腹部皮下取用等量脂肪組織，通過膠原酶消化法分離提取脂肪干細(xì)胞，計(jì)數(shù)原代單核細(xì)胞數(shù)，記錄細(xì)胞傳代時(shí)間，檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖活性。通過不同年齡段間ASCs細(xì)胞增殖能力的比較，明確不同年齡段間的細(xì)胞是否存在增殖能力的差異，為ASCs的臨床應(yīng)用提供更多依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、樣本分組。24例患者分組:第一組:

2、26-30歲6例，(27.50±1.52歲);第二組:31-35歲6例，（32.50±1.38歲）;第三組:36-40歲6例，(37.83±1.47歲);第四組:41-45歲6例，(42.67±1.63歲)。
　　 2、脂肪干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)。臨床于此四組行脂肪抽吸手術(shù)的女性患者腹部皮下獲取約50-100ml脂肪組織，PBS浸泡轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室，無菌條件下強(qiáng)力清洗至少3次，剔除可見的血管和結(jié)締組織，離心后取10ml脂肪組織，Ⅰ型膠原

3、酶37℃條件下消化30min，加入等量含10％FBS的DMEM，1000rpm室溫離心5min，棄去上清液及脂肪組織，加入紅細(xì)胞裂解液，500rpm、4℃離心5min，棄去上清液，以含10％FBS的DMEM重懸沉淀細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2培養(yǎng)箱，24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài)，并進(jìn)行第一次換液，以后每周換液2次。待原代細(xì)胞長至80％融合，按1∶3傳代，每2-3天換一次液，傳至第3代細(xì)胞備用。
　　

4、 3、原代ASCs有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)從脂肪組織中分離提取的原代細(xì)胞進(jìn)行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，于原代細(xì)胞培養(yǎng)至第10d計(jì)數(shù)收獲的有核細(xì)胞數(shù)，并記錄至原代細(xì)胞達(dá)80％融合時(shí)的各樣本所需時(shí)間。
　　 4、流式細(xì)胞儀測定ASCs細(xì)胞周期。選取生長至80％融合時(shí)的第3代ASCs細(xì)胞，消化并離心，以70％冰乙醇吹散后置入4℃條件下過夜固定，用預(yù)冷的PBS漂洗離心，以RNaseA37℃水浴處理30min,再加入PI染液4℃避光染色30min，上流式細(xì)

5、胞儀488nm檢測。
　　 5、MTT法測定ASCs細(xì)胞生長曲線。取不同年齡組的第3代ASCs，以5×103的細(xì)胞密度接種于96孔板中，按MTT法處理細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長曲線。測定細(xì)胞倍增時(shí)間(TD)，根據(jù)公式TD=t(lg2/lgNt-lgN0)換算出細(xì)胞倍增時(shí)間。
　　 6、實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行方差分析(P＜0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 四組間原代單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(P＞0.05

6、)，而細(xì)胞生長至80％融合時(shí)所需時(shí)間第二組與第三組、第三組與第四組比較(P＜0.05);低年齡組細(xì)胞傳代時(shí)間相對(duì)較短，細(xì)胞生長較迅速，集落范圍較大，數(shù)目多，且處于增殖期的細(xì)胞比例較多，細(xì)胞活性較好，而第四組細(xì)胞生長較慢，集落形成較小，數(shù)量少，第三組細(xì)胞處于增殖期的比例明顯高于第四組(P＜0.05)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著;細(xì)胞活性比較第二組與第三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而第二、三組與第四組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.05)。