食源性病原菌分子分型及其寡核苷酸膜陣列檢測技術(shù)的研究.pdf

1、背景：
　　 食源性疾病是由于食用或飲用了被致病因素污染的食物或飲料引起的疾病。常見的致病因素有病原微生物、天然毒素、寄生蟲和有毒有害化學(xué)物質(zhì)等。雖然毒素、有毒有害化學(xué)物質(zhì)等是食源性疾病的重要原因,但是病原菌才是引起食源性感染疾病發(fā)生的主要因素。
　　 由于全球化進(jìn)程的加快,全球貿(mào)易和人員來往日益頻繁,食源性感染已成為當(dāng)前一項(xiàng)重要的公共衛(wèi)生問題。無論發(fā)展中國家還是發(fā)達(dá)國家,每年都有很多爆發(fā)病例。流行病學(xué)監(jiān)測數(shù)據(jù)表明食源性

2、感染疾病的發(fā)病率持續(xù)上升,同時(shí)引起食源性感染的病原菌也逐漸表現(xiàn)出多樣化。除腸道病原菌外,近年來許多致病力很弱的菌株也成為食源性感染的病原菌。但許多公共衛(wèi)生部門并未充分認(rèn)識到食品安全的重要性,食源性感染疾病的預(yù)防控制仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。
　　 食源性感染病原菌的特征主要表現(xiàn)在菌株生物學(xué)特性的改變,如革蘭染色、菌落形態(tài)、血清學(xué)特性的變化等,但這些生物學(xué)特性改變往往使常規(guī)鑒定方法有時(shí)難以準(zhǔn)確的對病原菌進(jìn)行分類鑒定。食源性感染的另一特點(diǎn)是

3、發(fā)病人數(shù)往往較多、發(fā)病較快,如果疫情沒有及時(shí)處理,會有進(jìn)一步蔓延的可能性。
　　 如何對食源性感染病原菌進(jìn)行溯源以及快速鑒定是控制食源性感染的關(guān)鍵。隨著對細(xì)菌感染研究的日益深入,傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定技術(shù)已不能很好地滿足細(xì)菌感染的診斷和流行病學(xué)溯源的需要,從型、亞型、株,甚至分子水平上去鑒別細(xì)菌變得愈來愈重要,近年來隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展,使得細(xì)菌鑒定、耐藥基因的檢測、分子流行病學(xué)溯源變得更加準(zhǔn)確、簡潔和快速。多位點(diǎn)序列分型(M

4、ultilocus sequence typing,MLST)通過直接測定菌株的幾個(gè)看守基因的序列,與標(biāo)準(zhǔn)克隆株的等位基因圖譜比較,從而確定細(xì)菌的型別。其優(yōu)點(diǎn)在于可直接對標(biāo)本的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,無需培養(yǎng)病原菌,結(jié)果明確,易于標(biāo)準(zhǔn)化,不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果可以互相比較。目前在萬維網(wǎng)上已經(jīng)建立了腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、幽門螺桿菌等細(xì)菌的MLST全球數(shù)據(jù)庫。脈沖場凝膠電泳(Pulse-field gel electrophoresis,PFG

5、E)是近年興起的DNA指紋圖新技術(shù),它是對細(xì)菌的整個(gè)基因組進(jìn)行分析,能夠分辨20～500 kb的DNA片斷,最大分辨率可達(dá)5000kb,具有重復(fù)性好、分辨率高和容易標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn),可用于實(shí)驗(yàn)室室間比較?；蛐酒夹g(shù)(microarray)是一種反向固相雜交技術(shù),它將大量探針分子固定于支持物上,然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交,通過檢測雜交信號的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。由于用該技術(shù)可以將大量的探針同時(shí)固定于支持物上,因而基因芯片技術(shù)具有高通

6、量、并行處理、微型化和易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。目前,基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用已經(jīng)越來越廣泛,它可實(shí)現(xiàn)大量序列的平行鑒定,迅速敏感地檢測基因表達(dá)。基因芯片技術(shù)在病原微生物研究中已得到廣泛應(yīng)用,但是往往需要昂貴的點(diǎn)樣儀和掃描儀,給該技術(shù)的廣泛應(yīng)用帶來了不便。本項(xiàng)研究的目的是建立新的寡核苷酸膜陣列技術(shù),它不需要昂貴的檢測設(shè)備,同時(shí)保持檢測的敏感度和特異性。
　　 選擇同一基因片段可同時(shí)進(jìn)行多種致病菌的鑒別。該基因必須是所有病原

7、菌共有的基因片段,有一定的保守性,其序列的變異性又適合進(jìn)行屬種的鑒定。因此,病原微生物的保守基因常用作鑒別診斷的靶基因,如16S rRNA、23SrRNA、16-23S rRNA間隔區(qū)等是相對保守的基因。其中,16-23S rRNA間隔區(qū)雖種屬間變異較大,但片段較短；23S rRNA在細(xì)菌間的變異性較大,但序列不全,數(shù)據(jù)庫資料不完整；16S rRNA基因在種屬內(nèi)保守性較強(qiáng),并且序列齊全,常用于細(xì)菌的種系分類。熱休克蛋白60是一種高度保守

8、的蛋白質(zhì),其編碼基因groEL基因是生物進(jìn)化中的保守成分。groEL基因數(shù)據(jù)庫資料比較完整,國外已有科研人員選取其作為靶基因用于沙門氏菌、空腸彎曲菌及葡萄球菌等的分型鑒定。本研究選取groEL基因的一個(gè)變異區(qū)對引起食源性感染的17屬(種)常見病原菌,運(yùn)用寡核苷酸膜陣列技術(shù)進(jìn)行鑒別診斷。
　　 本學(xué)位論文主要研究:(1)運(yùn)用MLST和PFGE進(jìn)行食源性感染病原菌分子分型,用于溯源研究；(2)常見病原菌groEL基因序列同源與變異分

9、析,為細(xì)菌鑒別診斷和相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)；(3)應(yīng)用寡核苷酸膜陣列技術(shù),建立食源性感染病原菌的快速檢測方法。
　　 材料和方法：
　　 材料
　　 1.標(biāo)準(zhǔn)菌株:選取引起食源性感染的17種(屬)病原菌,它們是:大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、變形桿菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和空腸彎曲菌,肺炎鏈球菌、

10、銅綠假單胞菌和腦膜炎雙球菌為對照菌株。以上菌株均為本室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株。
　　 2.食源性感染模擬標(biāo)本:本研究將純種細(xì)菌培養(yǎng)物按10倍稀釋法從106稀釋混勻至100作為食源性感染模擬標(biāo)本。其中食源性感染模擬標(biāo)本1含有大腸埃希菌;食源性感染模擬標(biāo)本2含有腸炎沙門菌；食源性感染模擬標(biāo)本3含有單核細(xì)胞增生性李斯特菌；食源性感染模擬標(biāo)本4含有空腸彎曲菌；食源性感染模擬標(biāo)本5含有副溶血弧菌;食源性感染模擬標(biāo)本6含有普通變形桿菌。
　　

11、 3.食源性感染臨床標(biāo)本:2000年6月至2010年6月從廣州疚病預(yù)防控制中心收集20份食源性感染爆發(fā)臨床標(biāo)本。
　　 4.生物信息學(xué)軟件:Bioedit軟件,DNA star軟件包,Cluster W軟件,BioNumedcs4.0軟件,Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件和Primer express3.0熒光定量PCR設(shè)計(jì)軟件。
　　 方法
　　 1.根據(jù)管家基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行MLST分型和在細(xì)菌整個(gè)染色體基

12、因組上進(jìn)行PFGE分型,用于溯源分析。
　　 2.運(yùn)用GenBank數(shù)據(jù)庫和生物信息分析軟件,并通過PCR擴(kuò)增groEL基因片段,分析不同種屬細(xì)菌groEL基因的保守序列、變異規(guī)律及菌株間種系進(jìn)化關(guān)系。
　　 3.用groEL基因片段作為病原菌熒光定量PER檢測的靶區(qū)進(jìn)行檢測。
　　 4.運(yùn)用帶正電荷尼龍膜作為芯片載體,合成寡核苷酸探針,點(diǎn)樣于載體制成寡核苷酸芯片,對食源性感染常見病原菌、食源性感染模擬標(biāo)本和食源

13、性感染臨床標(biāo)本細(xì)菌groEL基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測。
　　 5.使用地高辛顯色系統(tǒng)對雜交結(jié)果進(jìn)行顯色分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.MLST分型中獲得了沙門菌8個(gè)血清群中的14個(gè)MLST型,食品來源沙門菌菌株的血清群有7個(gè),ST型為10個(gè),患者來源菌株血清群為5個(gè),ST型為10個(gè),實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)2個(gè)新的ST型,分別命名為New1-New2。沙門菌09群有4個(gè)ST型,其中以ST13最多；沙門菌010群和011群

14、都有2個(gè)ST型；沙門菌02群、03群、07群、08群都只有1個(gè)ST型。PFGE分型中沙門菌04群、07群、09群、011群分離株屬于A組；08群分離株屬于B組:02群、03群屬于C組。A組相似程度最高,B組其次,C組相似性最差。
　　 2.通過PCR擴(kuò)增和生物信息學(xué)比較分析,獲得34個(gè)groEL的通用保守序列,groEL基因保守序列與變異區(qū)在種系間呈間隔分布,大量變異區(qū)呈“馬賽克”式分布。種系問進(jìn)化關(guān)系與16S rRNA分析結(jié)果

15、大致一致。
　　 3.建立了用groEL基因片段作為檢測靶區(qū)病原菌熒光定量PCR檢測方法。
　　 4.在同一條件下運(yùn)用設(shè)計(jì)的通用引物擴(kuò)增出17種(屬)細(xì)菌groEL基因目標(biāo)片段。寡核苷酸芯片雜交結(jié)果表明,沙門菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、變形桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、溶血性鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌和空腸彎曲菌種(屬)細(xì)菌雜交結(jié)果顯示出高靈敏度和特異性。志賀菌與大腸埃希菌的出

16、現(xiàn)交叉反應(yīng)。肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌和腦膜炎雙球菌對照菌株沒有雜交反應(yīng)。本方法可以應(yīng)用于食源性感染模擬標(biāo)本和食源性感染臨床標(biāo)本的檢測。檢出水平可以達(dá)到101cfu/mL。
　　 5.建立了符合在基層推廣使用的地高辛顯色檢測結(jié)果分析方法。
　　 結(jié)論：
　　 1.運(yùn)用管家基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行MLST分型和運(yùn)用細(xì)菌整個(gè)基因組進(jìn)行PFGE分型,可用于食源性感染病原菌溯源分析。
　　 2.groEL基因序列變異性

17、規(guī)律為進(jìn)行細(xì)菌的鑒別診斷提供了重要的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 3.對于食源性感染模擬標(biāo)本,本方法可以獲得預(yù)期的結(jié)果。對食源性感染臨床標(biāo)本檢測的結(jié)果表明,本方法可以在屬及部分種水平進(jìn)行鑒定,但在亞種及血清型水平的鑒定需要結(jié)合傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒別。
　　 4.本研究只對細(xì)菌性食源性感染常見病原菌進(jìn)行膜陣列雜交的研究,該研究為制備高密度的功能齊全的芯片奠定了基礎(chǔ),下一步將進(jìn)行擴(kuò)大芯片容量和檢測范圍的研究,同時(shí)進(jìn)一步提高檢測的特異性。