鼠源單克隆抗體犬源化的研究.pdf

1、犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的成員,病毒粒子無(wú)囊膜,核衣殼為等軸對(duì)稱的二十面體,對(duì)外界抵抗力強(qiáng),CPV只有 CPV-2一個(gè)抗原型,該病傳染性強(qiáng),發(fā)病迅猛,病情嚴(yán)重,死亡率高,犬之間通過(guò)直接或間接接觸而傳播該病?發(fā)病犬有兩種表現(xiàn)型:心肌炎型與腸炎型?腸炎型以嚴(yán)重的嘔吐與嚴(yán)重的出血性腹瀉為主;心肌炎型以幼犬呼吸與心血管的衰竭為主要特征?犬細(xì)小病毒病治療尚無(wú)特效藥物,臨床治療時(shí)采用對(duì)癥治療?支

2、持療法和特異性療法結(jié)合應(yīng)用?其中特異性療法主要采用注射高免血清和單克隆抗體進(jìn)行治療,在 CPV感染早期,單克隆抗體治療效果顯著,然而鼠源單克隆抗體的異源性在臨床治療引起宿主免疫反應(yīng),使單抗療效降低,甚至誘發(fā)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)?因此有必要對(duì)其進(jìn)行改造，為此本研究首先建立了檢測(cè)犬免疫球蛋白G(IgG)的雙夾心ELISA方法,而后構(gòu)建嵌合抗體全長(zhǎng)基因質(zhì)粒并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá),為后期建立穩(wěn)定表達(dá)犬-鼠嵌合抗體細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)，為以后開發(fā)犬細(xì)小病毒病抗

3、體藥物治療提供支持。
　　本研究以兔抗犬 IgG Fc段多克隆抗體為包被抗體,過(guò)氧化酶標(biāo)記的兔抗犬IgG(全分子)多克隆抗體為檢測(cè)抗體,建立了雙抗體夾心 ELISA定量檢測(cè)方法,并采用Protein A方法從犬血清中純化犬IgG作為ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品?該檢測(cè)方法與小鼠?兔?馬?牛?雞及羊常見(jiàn)動(dòng)物血清無(wú)交叉反應(yīng),特異性好;最低檢測(cè)下限可以達(dá)到4.8 ng/mL,敏感性較高?目的在于提供一種檢測(cè)犬IgG的檢測(cè)方法以及便于后期檢測(cè)犬-

4、鼠嵌合抗體的表達(dá)和篩選穩(wěn)定表達(dá)犬-鼠嵌合抗體的細(xì)胞系?
　　本研究成功從雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增了抗體重鏈輕鏈可變區(qū),經(jīng) IMGT網(wǎng)站分析所擴(kuò)增的序列具有抗體功能,從犬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中擴(kuò)增了犬IgG重鏈輕鏈恒定區(qū),經(jīng)NCBI進(jìn)行Blast分析與犬IgG重鏈輕鏈基因同源性均在99％以上,并通過(guò)重疊延伸PCR成功拼接為嵌合序列,定向克隆至pcDNA3.1(+)載體上,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CHO細(xì)胞后,經(jīng) ELISA檢測(cè)成功表達(dá),并純化了