重組TNF-α人源單克隆抗體對(duì)食蟹猴長期毒性及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分重組TNF-α人源單克隆抗體的長期毒性研究
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)觀察食蟹猴皮下注射重組TNF-α人源單克隆抗體，每周一次，連續(xù)四周的毒性反應(yīng)，以及停藥四周的恢復(fù)情況。方法:30只健康食蟹猴按體重隨機(jī)分為5組:溶媒對(duì)照組、陽性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。每組6只，雌雄各半。低、中、高劑量組分別給予10.0、33.0和200.0 mg/kg的重組TNF-α人源單克隆抗體;陽性對(duì)照組給予33.0 mg/kg的阿達(dá)木單抗

2、(HUMIRA);溶媒對(duì)照組給予重組TNF-α人源單克隆抗體空白溶液。各組動(dòng)物按體重皮下注射給藥，給藥體積4ml/kg，每周給藥一次，共4次，恢復(fù)期四周。觀察癥狀和檢測(cè)指標(biāo)包括:(1)一般癥狀及指標(biāo):觀察食蟹猴的外觀，行為，活動(dòng)，步態(tài)，精神，食欲，大、小便，皮毛，有無流涎，惡心、嘔吐，有無震顫、共濟(jì)失調(diào)，有無死亡等。一般指標(biāo)包括體重、肛溫、呼吸、瞳孔共4項(xiàng)。(2)血液學(xué)指標(biāo):紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、血紅蛋白(HGB)定量、紅細(xì)胞壓積(HC

3、T)、紅細(xì)胞平均容積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLAT)計(jì)數(shù)、白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)、粒細(xì)胞(NEUT)、淋巴細(xì)胞(LYMPH)、單核細(xì)胞(MONO)、嗜酸性細(xì)胞(EOS)、嗜堿性細(xì)胞(BASO)、大未染色細(xì)胞(LUC)、網(wǎng)織紅細(xì)胞(RETIC)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)和血漿纖維蛋白原(FIB)共19項(xiàng)。(3)血液生化指標(biāo):

4、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、尿素(BU)、肌酐(CREA)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、總膽固醇(Tch)、甘油三脂(TG)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)、尿酸(UA)、血清鈣(Ca)、血清磷(P)、血清鉀(K)、鈉(Na)和氯(Cl)共檢測(cè)20項(xiàng)。(4)尿液檢查項(xiàng)目:葡萄糖、蛋白質(zhì)、膽紅素、尿膽

5、原、pH、比重、紅細(xì)胞、酮體、亞硝酸鹽和白細(xì)胞共10項(xiàng)。(5)骨髓檢查:解剖的全部動(dòng)物取胸骨進(jìn)行骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類。(6)病理學(xué)檢查:給藥和觀察期結(jié)束后解剖，對(duì)心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腦、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮和卵巢進(jìn)行稱重，觀察心、肝、脾、肺、腎、腦（大腦、小腦、腦干）、垂體、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結(jié)腸、直腸、盲腸）、氣管、食管、主動(dòng)脈、頜下腺、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺、胸腺、胰腺、腸系膜淋巴結(jié)、前列腺、

6、膀胱、睪丸、附睪、子宮、卵巢、乳腺、眼球、視神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、脊椎（頸、胸、腰段）、胸骨和給藥部位有無病變。結(jié)果:(1)藥物對(duì)食蟹猴的體重、肛溫、呼吸和瞳孔無明顯影響。(2)藥物引起RBC、HGB、HCT降低，RETIC％升高，恢復(fù)期時(shí)可恢復(fù)正常，提示藥物對(duì)猴血液學(xué)指標(biāo)有一定的影響，其他血液學(xué)指標(biāo)未見與給藥相關(guān)的明顯變化。(3)藥物對(duì)血液生化指標(biāo)無明顯影響。(4)藥物對(duì)尿液指標(biāo)無影響。(5)骨髓細(xì)胞檢查結(jié)果表明，藥物對(duì)食蟹猴骨髓細(xì)胞中的紅

7、細(xì)胞系有不同程度的刺激增生作用。(6)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，藥物引起食蟹猴胸腺和脾臟萎縮，以及胸腺、脾臟淋巴細(xì)胞減少，恢復(fù)期時(shí)有恢復(fù)趨勢(shì);藥物引起動(dòng)物骨髓紅細(xì)胞系輕度增生，恢復(fù)期結(jié)束，各組未見明顯病理改變。結(jié)論:重組TNF-α人源單克隆抗體長期給藥對(duì)食蟹猴有明顯的免疫毒性，能夠引起免疫器官胸腺和脾臟的萎縮;藥物可能存在血液系統(tǒng)毒性，可能引起機(jī)體貧血;藥物對(duì)免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的毒性作用可逆。
　　
　　 第二部分重組TNF-α人

8、源單克隆抗體免疫毒性機(jī)制研究
　　 目的:探討重組TNF-α人源單克隆抗體引起食蟹猴胸腺和脾臟萎縮的可能機(jī)制。方法:食蟹猴皮下注射重組TNF-α人源單克隆抗體10.0、33.0和200.0 mg/kg，陽性對(duì)照組皮下注射33.0 mg/kg的阿達(dá)木單抗(HUMIRA)，溶媒對(duì)照組皮下注射等體積的重組TNF-α人源單克隆抗體空白溶液，每周給藥一次，連續(xù)四周，恢復(fù)期四周。給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束進(jìn)行下列試驗(yàn):(1)重組TNF-α人源單克

9、隆抗體對(duì)食蟹猴胸腺和脾臟細(xì)胞凋亡的影響試驗(yàn);(2)重組TNF-α人源單克隆抗體對(duì)食蟹猴胸腺細(xì)胞細(xì)胞周期的影響試驗(yàn);(3)重組TNF-α人源單克隆抗體對(duì)食蟹猴胸腺細(xì)胞增殖的影響試驗(yàn);(4)重組TNF-α人源單克隆抗體對(duì)食蟹猴胸腺細(xì)胞發(fā)育的影響試驗(yàn);(5)外周血T淋巴細(xì)胞表型(CD3/CD4/CD8)測(cè)定試驗(yàn)。結(jié)果:(1)胸腺細(xì)胞hoechest染色結(jié)果表明，包括陽性對(duì)照組在內(nèi)的各給藥組hoechest陽性細(xì)胞比例與溶媒對(duì)照組相比沒有明顯差

10、異;胸腺TUNEL染色結(jié)果表明，陽性對(duì)照組及各給藥組TUNEL陽性染色細(xì)胞比例與溶媒對(duì)照組相比沒有明顯差異。以上結(jié)果提示，重組TNF-α人源單克隆抗體長期給藥未引起胸腺及脾臟細(xì)胞凋亡。(2)體外培養(yǎng)胸腺細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，重組TNF-α人源單克隆抗體將胸腺細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于Go/G1期;(3)體外培養(yǎng)胸腺細(xì)胞的細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明，重組TNF-α人源單克隆抗體引起EdU陽性細(xì)胞比例的顯著下降，表明重組TNF-α人源單克隆抗體抑

11、制了胸腺細(xì)胞的增殖;(4)藥物對(duì)食蟹猴胸腺細(xì)胞發(fā)育的影響試驗(yàn)表明，阿達(dá)木單抗及各劑量的重組TNF-α人源單克隆抗體給藥后引起胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞數(shù)量的明顯減少，但CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD4+、CD8+胸腺細(xì)胞的比例在各給藥組與溶媒對(duì)照組之間沒有明顯差異;(5)外周血T淋巴細(xì)胞表型檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果提示，各給藥組的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值均與溶媒對(duì)照組沒有顯著差異。結(jié)論:(1