伊伐布雷定對新生大鼠心房肌細(xì)胞HCN通道的影響.pdf

1、目的：
　　超極化激活環(huán)核苷酸門控通道(hyperpolarization-activation cyclic nucleotide-gated channel，HCN channel）是一類非選擇性的陽離子通道。研究表明在哺乳類動(dòng)物心臟上表達(dá)有HCN1、HCN2、HCN4三種通道亞型，其中HCN2、HCN4在正常情況下共同參與并維持心臟正常生理活動(dòng)。HCN通道介導(dǎo)的起搏電流 If為一類超極化激活電流，在心臟自主節(jié)律的形成和變時(shí)功

2、能調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的生理及病理生理學(xué)功能。采用模型細(xì)胞異源表達(dá)HCN通道，并成功記錄到由該離子通道介導(dǎo)的超極化激活電流，從而證實(shí)該電流的分子基礎(chǔ)為HCN通道蛋白。心房顫動(dòng)（Atrial Fibrillation，AF），簡稱房顫，是臨床最常見的快速型心律失常之一。大量研究顯示，相對于竇性心律患者，房顫患者心房肌組織中HCN通道表達(dá)異常增加，因此推測HCN通道可能是房顫治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。伊伐布雷定(Ivabradine，Iva)是一種

3、If電流的選擇特異性阻滯劑，目前適用于慢性穩(wěn)定性心絞痛、心力衰竭等心血管疾病的藥物治療。臨床研究表明，伊伐布雷定可降低快速型心律失常的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間，但具體作用機(jī)制仍未闡明。本實(shí)驗(yàn)擬在新生大鼠心房肌細(xì)胞上建立快速起搏模型，探討伊伐布雷定對HCN通道的表達(dá)及功能的影響，進(jìn)而改善心房肌細(xì)胞凋亡水平，減輕房顫狀態(tài)下心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，為該藥在抗房顫的藥物治療方面提供更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　方法：
　?。?）原代新生大鼠心房肌細(xì)胞分離及培

4、養(yǎng)：選取出生1~3天的Sprague Dawley（SD）大鼠。在相對無菌環(huán)境下，固定乳大鼠的四肢，于胸骨劍突下開胸，完全暴露心臟后，使用無菌鑷子夾取完整心臟放入盛有無菌PBS的P6培養(yǎng)皿中，擠壓心腔中殘留血液后，將心臟轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，分離出左、右心耳，收集并轉(zhuǎn)移心耳組織至T25玻璃培養(yǎng)瓶中，加入0.25％胰蛋白酶2 ml，靜置于4℃環(huán)境，14~16 h后終止胰蛋白酶的消化。繼續(xù)用II型膠原酶消化液在37℃水浴條件下消化5~10 m

5、in，離心后收集心房肌細(xì)胞并接種于P10培養(yǎng)皿，放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行差速貼壁，收集細(xì)胞懸液均勻接種于P6培養(yǎng)皿或者6孔板，細(xì)胞個(gè)數(shù)約1×104/cm2，并加入成纖維細(xì)胞抑制劑5-Brdu（終濃度：100μM），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后倒置相差顯微鏡觀察，細(xì)胞貼壁良好，更換新的完全培養(yǎng)基，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
　?。?）進(jìn)行心肌細(xì)胞鑒定。將心房肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對照組（Control）：完全培養(yǎng)基正

6、常培養(yǎng)；藥物干預(yù)組（Iva）：在培養(yǎng)基中加入終濃度為10μM的Ivabradine；電刺激組（Pacing）：建立快速起搏模型，給予心房肌細(xì)胞強(qiáng)度10 V、頻率10 Hz、時(shí)長24 h的持續(xù)電刺激；電刺激干預(yù)組（Pacing+iva）：在給予心房肌細(xì)胞同條件電刺激的同時(shí)加入終濃度10μM Ivabradine進(jìn)行藥物干預(yù)；
　　（3）Real-Time PCR檢測各組mRNA、microRNA表達(dá)差異：
　　1）提取心房肌細(xì)

7、胞中的總RNA，260/280均在1.8~2.0之間；繼而采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將已提取出的心房肌總 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green I法Real-Time PCR檢測各組間HCN2、HCN4 mRNA水平的差異。
　　2）使用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit試劑盒提取心房肌細(xì)胞microRNA，按照All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR試劑盒檢測各組microRNA-1、micr

8、oRNA-133的表達(dá)差異。
　　（4）Western blotting實(shí)驗(yàn)：RIPA（含蛋白酶抑制劑）提取心房肌細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白質(zhì)濃度，變性備用。取心房肌細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h后，運(yùn)用Bio-Rad凝膠成像處理系統(tǒng)檢測蛋白條帶，采用Quantity One軟件分析各組間HCN2、HCN4以及凋亡誘導(dǎo)

9、因子（Apoptosis-inducing factor，AIF）的蛋白表達(dá)差異。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）：采用凋亡試劑盒，按照說明對各組心房肌細(xì)胞進(jìn)行處理，流式細(xì)胞儀對各組心房肌細(xì)胞進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測。
　?。?）全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)：于倒置相差顯微鏡下選擇立體感好、折光性強(qiáng)的單個(gè)心房肌細(xì)胞進(jìn)行If電流記錄。
　　結(jié)果：
　?。?）Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)：
　　1）

10、Iva組較 Control組HCN2 mRNA表達(dá)量上調(diào)（n=6，P<0.01），HCN4 mRNA表達(dá)量上調(diào)（n=6，P<0.05）；Pacing組較Control組HCN2 mRNA表達(dá)量上調(diào)（n=6，P<0.01），HCN4 mRNA表達(dá)量上調(diào)（n=6，P<0.05）；Pacing+iva組較Pacing組HCN2 mRNA表達(dá)量下調(diào)（n=6，P<0.05），HCN4 mRNA表達(dá)量下調(diào)（n=6，P<0.05）；
　　2）I

11、va組較Control組microRNA-1表達(dá)量下調(diào)（n=6，P<0.01），microRNA-133表達(dá)量下調(diào)（n=6，P<0.01）；Pacing組較 Control組 microRNA-1表達(dá)量下調(diào)（n=6，P<0.01），microRNA-133表達(dá)量下調(diào)（n=6，P<0.01）；Pacing+iva組較Pacing組microRNA-1表達(dá)量上調(diào)（n=6，P<0.01），microRNA-133表達(dá)量上調(diào)（n=6，P<0.0

12、1）。
　　（2）Western blotting實(shí)驗(yàn)：Iva組較Control組HCN2通道蛋白表達(dá)量上調(diào)（n=5，P<0.01），HCN4通道蛋白表達(dá)量上調(diào)（n=5，P<0.01），AIF表達(dá)無明顯差異（n=5，P>0.05）；Pacing組較Control組HCN2通道蛋白表達(dá)量上調(diào)（n=5，P<0.01），HCN4通道蛋白表達(dá)量上調(diào)（n=5，P<0.01），AIF表達(dá)量明顯增加（n=5，P<0.01）；Pacing+iva

13、組較Pacing組HCN2通道蛋白表達(dá)量下調(diào)（n=5，P<0.01），HCN4通道蛋白表達(dá)量下調(diào)（n=5，P<0.01），AIF表達(dá)量顯著下降（n=5，P<0.01）。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）：Iva組較Control組心房肌細(xì)胞早期凋亡率無明顯變化（n=5，P>0.05）；Pacing組較Control組心房肌細(xì)胞早期凋亡率顯著升高（n=5，P<0.01）；Pacing+iva組較Pacin

14、g組心房肌細(xì)胞早期凋亡率明顯下降（n=5，P<0.01）。
　?。?）全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)：膜電位為?150 mV時(shí)，Iva組較Control組，心房肌細(xì)胞If電流密度顯著減?。?4.83±1.97 pA/pF Vs.?12.49±3.26 pA/pF（n=6，P<0.01）；Pacing組較Control組，心房肌細(xì)胞If電流密度增大：?17.32±2.73 pA/pF Vs.?12.49±3.26 pA/pF（n=6，P<0.05

15、）；Pacing+iva組較Pacing組，心房肌細(xì)胞If電流密度明顯減?。?5.05±2.27 pA/pF Vs.?17.32±2.73 pA/pF（n=6， P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　（1）胰蛋白酶聯(lián)合II型膠原酶消化法，培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞數(shù)量多，貼壁好，具有良好心肌細(xì)胞電生理特性，可供后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和電生理研究使用；
　　（2）成功建立了新生大鼠心房肌細(xì)胞快速起搏模型，該模型可用于模擬房顫的病理狀態(tài)；<