體外新生大鼠海馬缺氧缺血模型中自噬相關分子的表達及Ca-A-K通道在自噬中的作用機制.pdf

1、目的：通過觀察體外新生大鼠缺氧缺血性損傷模型，了解海馬神經(jīng)元的損傷情況，以及損傷后不同時間點及各組間細胞自噬變化和Ca-A/K通道亞基情況，探討自噬抑制劑3-methyladenine（3-MA）對自噬調(diào)節(jié)及對細胞存活的影響，并初步研究缺氧缺糖后Ca-A/K通道亞基變化與自噬的關系。
　　方法：采用新生24小時以內(nèi)的SD（Sprague Dawley）大鼠進行海馬細胞原代培養(yǎng)，行氧糖剝奪(oxygen glucose depriv

2、ation，OGD)的處理方法，模擬神經(jīng)元缺氧缺血模型。選取氧糖剝奪后0h、6h、12h、24 h、48 h、72 h、96 h七個時間點，通過Western blot及RT-qPCR法測定氧糖剝奪前后海馬神經(jīng)元自噬相關蛋白（LC-3、Beclin-1）、mRNA的變化和Ca-A/K通道亞基（GluR1、GluR2、GluR3）的蛋白變化；透射電鏡下檢測自噬的特異性結(jié)構(gòu)；用CCK8法檢測細胞活性，采用Fluo-3AM流式檢測缺氧缺血后[

3、Ca2+]i的水平變化，應用自噬抑制劑3-MA干預后，行上述檢測，初步探討自噬和Ca-A/K通道的關系及可能機制。
　　結(jié)果：
　　1、電鏡結(jié)果顯示，相比正常條件下的神經(jīng)元，缺氧缺糖后神經(jīng)元細胞漿內(nèi)有大量自噬體形成；預先采用3-MA干預的細胞組也有自噬體形成，但比缺氧缺糖組明顯降低。
　　2、RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，缺氧缺糖組0.5h和1h組LC3、Beclin-1均表達上升，缺氧缺糖0.5h組在0h表達

4、就開始上升，48h達到高峰后開始下降。缺氧缺糖1h組則72h達到高峰后下降，且比缺氧缺糖0.5h組表達量增高；3-MA干預1h組則在模型后6h就呈現(xiàn)下降，12h趨向正常水平。
　　3、Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，缺氧缺糖0.5h組和1h組LC3、Beclin-1均表達升高，缺氧缺糖0.5h組在6h達到高峰，48h后開始下降。缺氧缺糖1h組則12h達到高峰后呈現(xiàn)下降趨勢；且比缺氧缺糖0.5h組表達增強，3MA干預

5、1h組在6h后呈現(xiàn)下降趨勢；缺氧缺糖1h組的GluR1、GluR3在缺氧缺糖后6h表達上升，持續(xù)到24h后下降，而GluR2則在6h表達下降，持續(xù)到24恢復正常水平。
　　4、CCK8結(jié)果顯示，缺氧缺糖損傷恢復正常條件24h后細胞存活率為71±1％，48h存活率為80±4%，相應的在每個時間點給予3-MA預處理后細胞存活率分別為75±5%、82±4%，無顯著性差（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．成功培養(yǎng)了原代海馬

6、細胞并建立了體外缺氧缺血模型。
　　2．缺氧缺糖后自噬標記蛋白LC-3、Beclin-1及Ca-A/K通道亞基GluR1、GluR2、GluR3的表達發(fā)生變化。
　　3.在一定程度損傷內(nèi)，細胞自噬會隨缺氧缺糖時間延長而增加。
　　4.3-MA可影響上述自噬相關蛋白在缺氧缺糖中的表達，抑制自噬減輕細胞損傷。
　　5.缺氧缺糖損傷后，Ca-A/K通道發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，提示形成以GluR2亞基減少為主的新通道，介導Ca2+