CRISPR-Cas9技術(shù)編輯水稻香味基因及靶向突變檢測方法的研究.pdf

1、香稻因其宜人的香味而受到全世界的青睞。傳統(tǒng)的育種方式在一定范圍內(nèi)能夠提高水稻產(chǎn)量和米質(zhì)，但是效果不夠顯著，且工作量大，工作周期長。CRISPR/Cas編輯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為分子育種開辟了新的途徑。因編碼甜菜堿醛脫氫酶基因BADH2功能缺失后，可導(dǎo)致一個主要的香氣化合物2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量增多，使稻米產(chǎn)生香味。因此，本文利用CRISPR/Cas9靶向編輯技術(shù)，針對BADH2第2外顯子和第7外顯子分別設(shè)計靶標(biāo)位點(diǎn)Badh2K

2、O1和Badh2KO2，通過水稻遺傳轉(zhuǎn)化共獲得轉(zhuǎn)基因植株94株。通過對94株轉(zhuǎn)化植株的BADH2基因測序結(jié)果可知，Badh2KO1的突變植株為25株，突變率27％;Badh2KO2的突變植株為59株，突變率63％;野生型植株為10株。通過遺傳分離得到純合突變植株。Sanger測序證實(shí)這些突變植株中BADH2基因發(fā)生堿基缺失和插入，致使編碼蛋白的氨基酸序列均有不同程度的改變，且GC-MS技術(shù)檢測出這些突變植株中的2-AP含量明顯提高。這些

3、結(jié)果表明，CRISPR/Cas9可以定向編輯水稻香味基因，使稻米具有香味。
　　突變檢測是植物CRISPR/Cas9靶向突變研究的必要環(huán)節(jié)。為了比較不同檢測方式的特點(diǎn)，本研究以一個水稻T0代CRISPR/Cas9靶向群體為材料，比較了目前常用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析、T7核酸內(nèi)切酶分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、高分辨率溶解曲線分析以及直接測序分析等5種檢測手段的準(zhǔn)確性和靈敏性。我們的結(jié)果表明這些方法檢出陽性結(jié)果的真實(shí)性均較高，但