利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對本氏煙草基因編輯的基礎(chǔ)研究.pdf

1、CRISPR/Cas9是發(fā)現(xiàn)于古細菌和細菌中的一種獲得性免疫防御機制，通過攝取入侵的外源DNA短片段最終形成宿主的間隔序列，從而介導對病毒和質(zhì)粒的獲得性抗性。由于該系統(tǒng)相對于以前的基因編輯方法更簡單易行、可靠高效、靶標精準而被廣泛應(yīng)用到多種生物的基因編輯中，成為一個準確打靶的基因編輯工具。
　　本研究以本氏煙草為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)本氏煙草內(nèi)源PDS（Phytoenedesaturase，八氫番茄紅素脫氫酶）基

2、因和外源GFP(Green FluorescentProtein，綠色熒光蛋白)基因的編輯工作，建立了本氏煙草CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的瞬時表達系統(tǒng)和穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系，進而探討了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組編輯中的應(yīng)用，為將來開展其它內(nèi)源基因的生物學功能研究奠定了基礎(chǔ)。本論文針對本氏煙草內(nèi)源基因PDS和外源基因GFP分別預測了3個和4個靶標位點，并設(shè)計合成了相應(yīng)的guide序列和構(gòu)建了雙元表達重組載體。其中，將中間克

3、隆載體psgR-Cas9-At質(zhì)粒成功地改造成了操作性強的In-Fusion克隆載體psgR-Cas9-IF-At。將成功構(gòu)建的雙元表達重組載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中并通過注射法侵染本氏煙草葉片。GFP基因的4個guide序列重組子轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌分別侵染轉(zhuǎn)基因本氏煙草16C-NB(16C transgenic Nicotiana benthamiana，16C-NB)葉片（16C-NB過表達GFP基因），通過基因組DNA PCR-RE方法驗證CR

4、ISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效果，PCR-RE結(jié)果顯示只有GFP-guide-1和GFP-guide-3有編輯效果。PDS基因的3個靶標序列重組子轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌侵染野生型本氏煙草17WT-NB（17 Wild Type-Nicotiana benthamiana）葉片，通過基因組DNA RE-PCR方法驗證該系統(tǒng)的編輯效果，RE-PCR結(jié)果初步顯示PDS-guide-1有編輯效果。
　　本論文將PDS基因的3個guide序列兩兩組合

5、(即PTG-1+2，PTG-1+3，PTG-2+3)進行多位點編輯試驗來進一步驗證CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效果。將兩兩組合的guide序列克隆到雙元表達載體中并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中侵染本氏煙草17WT-NB，通過PCR方法檢測其編輯效果，PCR結(jié)果初步顯示只有PTG-1+2有編輯效果。在以上工作基礎(chǔ)上，針對PDS-guide-1進行農(nóng)桿菌介導的葉盤遺傳轉(zhuǎn)化實驗以期獲得單個位點編輯的轉(zhuǎn)基因植株。通過該方法獲得了99株轉(zhuǎn)基因植株，PCR結(jié)