利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)本氏煙草基因編輯的基礎(chǔ)研究.pdf

1、CRISPR/Cas9是發(fā)現(xiàn)于古細(xì)菌和細(xì)菌中的一種獲得性免疫防御機(jī)制，通過攝取入侵的外源DNA短片段最終形成宿主的間隔序列，從而介導(dǎo)對(duì)病毒和質(zhì)粒的獲得性抗性。由于該系統(tǒng)相對(duì)于以前的基因編輯方法更簡(jiǎn)單易行、可靠高效、靶標(biāo)精準(zhǔn)而被廣泛應(yīng)用到多種生物的基因編輯中，成為一個(gè)準(zhǔn)確打靶的基因編輯工具。
　　本研究以本氏煙草為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)本氏煙草內(nèi)源PDS（Phytoenedesaturase，八氫番茄紅素脫氫酶）基

2、因和外源GFP(Green FluorescentProtein，綠色熒光蛋白)基因的編輯工作，建立了本氏煙草CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系，進(jìn)而探討了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組編輯中的應(yīng)用，為將來開展其它內(nèi)源基因的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。本論文針對(duì)本氏煙草內(nèi)源基因PDS和外源基因GFP分別預(yù)測(cè)了3個(gè)和4個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)合成了相應(yīng)的guide序列和構(gòu)建了雙元表達(dá)重組載體。其中，將中間克

3、隆載體psgR-Cas9-At質(zhì)粒成功地改造成了操作性強(qiáng)的In-Fusion克隆載體psgR-Cas9-IF-At。將成功構(gòu)建的雙元表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中并通過注射法侵染本氏煙草葉片。GFP基因的4個(gè)guide序列重組子轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌分別侵染轉(zhuǎn)基因本氏煙草16C-NB(16C transgenic Nicotiana benthamiana，16C-NB)葉片（16C-NB過表達(dá)GFP基因），通過基因組DNA PCR-RE方法驗(yàn)證CR

4、ISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效果，PCR-RE結(jié)果顯示只有GFP-guide-1和GFP-guide-3有編輯效果。PDS基因的3個(gè)靶標(biāo)序列重組子轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌侵染野生型本氏煙草17WT-NB（17 Wild Type-Nicotiana benthamiana）葉片，通過基因組DNA RE-PCR方法驗(yàn)證該系統(tǒng)的編輯效果，RE-PCR結(jié)果初步顯示PDS-guide-1有編輯效果。
　　本論文將PDS基因的3個(gè)guide序列兩兩組合

5、(即PTG-1+2，PTG-1+3，PTG-2+3)進(jìn)行多位點(diǎn)編輯試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效果。將兩兩組合的guide序列克隆到雙元表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中侵染本氏煙草17WT-NB，通過PCR方法檢測(cè)其編輯效果，PCR結(jié)果初步顯示只有PTG-1+2有編輯效果。在以上工作基礎(chǔ)上，針對(duì)PDS-guide-1進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)以期獲得單個(gè)位點(diǎn)編輯的轉(zhuǎn)基因植株。通過該方法獲得了99株轉(zhuǎn)基因植株，PCR結(jié)