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文檔簡介
1、防御素是一類富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽.它是動物體內(nèi)防御系統(tǒng)中最大的成員,主要存在于哺乳動物中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞中.防御素具有廣譜的抗菌,抗病毒等活性,同時,動物防御索還可以調(diào)節(jié)體內(nèi)粘膜免疫及其他抗微生物免疫活性。防御素廣泛表達(dá)在動物組織細(xì)胞中,在雌性生殖道中也分布著大量防御素。由于防御索參與天然免疫防御機制,提示防御素可能在雌性生殖系統(tǒng)抵抗微生物感染、維持生殖健康方面起至關(guān)重要的作用。生殖道上皮細(xì)胞中防御素的表達(dá)受到一些激素的調(diào)節(jié),特
2、別和雌激素、孕酮有密切的關(guān)系。提示雌激素可能參與了對生殖道上皮細(xì)胞的防御素表達(dá)調(diào)節(jié)過程,但雌激素是如何實現(xiàn)調(diào)控仍不清楚。
目前,有關(guān)綿羊雌性生殖道防御素和生殖激素的關(guān)系的研究極少,也未見生殖激素對綿羊生殖道防御素調(diào)控機制的研究。為此,我們初步探討了雌激素對綿羊輸卵管上皮細(xì)胞防御素(SBD-1,SBD-2)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其信號通路。結(jié)果如下:
1、首先建立穩(wěn)定的綿羊輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系.在無菌條件下獲取
3、綿羊輸卵管上皮細(xì)胞,并用0.05%胰酶句.02%EDTA消化方法,以及差速貼壁法以獲取較純的綿羊輸卵管上皮細(xì)胞,對綿羊輸卵管上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),以及至少摶2代的傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示:經(jīng)免疫組化方法和形態(tài)學(xué)方法鑒定,證實所培養(yǎng)細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞特征。并且對傳2代細(xì)胞繪制細(xì)胞生長曲線和進(jìn)行染色體核型分析,證實細(xì)胞生長狀態(tài)良好以及沒有發(fā)生變異。可以作為下一步研究的實驗?zāi)P汀?br> 2、我們首先確定在綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中是否有SBD
4、-1和SBD-2表達(dá),根據(jù)己發(fā)表的SBD-1和SBD-2序列設(shè)計特異性引物,經(jīng)RT-PCR鑒定及測序證明這兩種基因在綿羊輸卵管上皮細(xì)胞有表達(dá)。然后探討雌激素對綿羊輸卵管上皮細(xì)胞防御素的表達(dá)影響以及是否存在著時間上與劑量上的依賴關(guān)系。我們在綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中添加不同劑量(10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M)17B.雌二醇處理不同時間(2h6h、12h、24h、48h),然后采用實時熒光定量R1-PCR技術(shù)檢測雌
5、激素對綿羊輸卵管上皮細(xì)胞p-防御素(SBD-1,SBD-2)的表達(dá)水平。結(jié)果表明:17p.雌二醇對綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-1和SBD-2均存在著明顯時間效應(yīng)和劑量依賴關(guān)系,17B-雌二醇在其劑量為10-88M、處理細(xì)胞6小時后對SBD-1和SBD-2的上調(diào)幅度最大。
3、為了進(jìn)一步明確是何種信號通路介導(dǎo)雌激素對綿羊輸卵管上皮細(xì)胞防御素(SBD-1-SBD-2)表達(dá)的影響,我們采用雌激素核受體阻斷劑、膜受體途徑可能信號通
6、路阻斷劑和GPR30的激動劑處理細(xì)胞,然后采用實時熒光定量RT—PCR技術(shù)檢測SBD-1mRNA和SBD-2:mRNA的表達(dá)變化水平。結(jié)果表明:①17B.雌二醇誘導(dǎo)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-1和SBD-2 基因表達(dá)均是由雌激素膜受體途徑和雌激素核受體途徑共同介導(dǎo)的,并且雌激素核受體途徑是主效通路。⑧17B-雌二醇誘導(dǎo)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-1基因表達(dá)是由雌激素核受體、PKA、NF-KBkB和PKC途徑所介導(dǎo)的。⑧178.雌二醇誘導(dǎo)
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