17B-雌二醇對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞B-防御素基因表達(dá)的影響及可能的信號(hào)通路.pdf

1、防御素是一類富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽．它是動(dòng)物體內(nèi)防御系統(tǒng)中最大的成員，主要存在于哺乳動(dòng)物中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞中．防御素具有廣譜的抗菌，抗病毒等活性，同時(shí)，動(dòng)物防御索還可以調(diào)節(jié)體內(nèi)粘膜免疫及其他抗微生物免疫活性。防御素廣泛表達(dá)在動(dòng)物組織細(xì)胞中，在雌性生殖道中也分布著大量防御素。由于防御索參與天然免疫防御機(jī)制，提示防御素可能在雌性生殖系統(tǒng)抵抗微生物感染、維持生殖健康方面起至關(guān)重要的作用。生殖道上皮細(xì)胞中防御素的表達(dá)受到一些激素的調(diào)節(jié)，特

2、別和雌激素、孕酮有密切的關(guān)系。提示雌激素可能參與了對(duì)生殖道上皮細(xì)胞的防御素表達(dá)調(diào)節(jié)過(guò)程，但雌激素是如何實(shí)現(xiàn)調(diào)控仍不清楚。
　　 目前，有關(guān)綿羊雌性生殖道防御素和生殖激素的關(guān)系的研究極少，也未見生殖激素對(duì)綿羊生殖道防御素調(diào)控機(jī)制的研究。為此，我們初步探討了雌激素對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞防御素(SBD-1，SBD-2)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其信號(hào)通路。結(jié)果如下：
　　 1、首先建立穩(wěn)定的綿羊輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系．在無(wú)菌條件下獲取

3、綿羊輸卵管上皮細(xì)胞，并用0．05％胰酶句．02％EDTA消化方法，以及差速貼壁法以獲取較純的綿羊輸卵管上皮細(xì)胞，對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，以及至少摶2代的傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示：經(jīng)免疫組化方法和形態(tài)學(xué)方法鑒定，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞特征。并且對(duì)傳2代細(xì)胞繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和進(jìn)行染色體核型分析，證實(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好以及沒(méi)有發(fā)生變異?？梢宰鳛橄乱徊窖芯康膶?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 2、我們首先確定在綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中是否有SBD

4、-1和SBD-2表達(dá)，根據(jù)己發(fā)表的SBD-1和SBD-2序列設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)RT-PCR鑒定及測(cè)序證明這兩種基因在綿羊輸卵管上皮細(xì)胞有表達(dá)。然后探討雌激素對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞防御素的表達(dá)影響以及是否存在著時(shí)間上與劑量上的依賴關(guān)系。我們?cè)诰d羊輸卵管上皮細(xì)胞中添加不同劑量(10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M)17B．雌二醇處理不同時(shí)間(2h6h、12h、24h、48h)，然后采用實(shí)時(shí)熒光定量R1-PCR技術(shù)檢測(cè)雌

5、激素對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞p-防御素(SBD-1，SBD-2)的表達(dá)水平。結(jié)果表明：17p．雌二醇對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-1和SBD-2均存在著明顯時(shí)間效應(yīng)和劑量依賴關(guān)系，17B-雌二醇在其劑量為10-88M、處理細(xì)胞6小時(shí)后對(duì)SBD-1和SBD-2的上調(diào)幅度最大。
　　 3、為了進(jìn)一步明確是何種信號(hào)通路介導(dǎo)雌激素對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞防御素(SBD-1-SBD-2)表達(dá)的影響，我們采用雌激素核受體阻斷劑、膜受體途徑可能信號(hào)通

6、路阻斷劑和GPR30的激動(dòng)劑處理細(xì)胞，然后采用實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR技術(shù)檢測(cè)SBD-1mRNA和SBD-2：mRNA的表達(dá)變化水平。結(jié)果表明：①17B．雌二醇誘導(dǎo)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-1和SBD-2 基因表達(dá)均是由雌激素膜受體途徑和雌激素核受體途徑共同介導(dǎo)的，并且雌激素核受體途徑是主效通路。⑧17B-雌二醇誘導(dǎo)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-1基因表達(dá)是由雌激素核受體、PKA、NF-KBkB和PKC途徑所介導(dǎo)的。⑧178．雌二醇誘導(dǎo)