KLF5在DCA介導下誘導食管鱗狀上皮向柱狀上皮轉分化的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　Barrett食管（Barrett's esophagus，簡稱BE）是指遠端食管鱗狀上皮被化生的柱狀上皮所取代的病理現(xiàn)象，是食管腺癌重要的癌前病變。由于BE具有易癌變的特性，使其在臨床受到高度重視并成為研究食管腺癌的主要對象。雖然BE于19世紀50年代已在病理學上被定義、19世紀70年代已經(jīng)被認為是食管腺癌的形成因素，但對于引起B(yǎng)arrett食管的分子機制，我們的了解仍然非常有限。
　　臨床觀察表明，多數(shù)食管腺

2、癌的發(fā)生經(jīng)歷了胃食管反流(GERD)、BE至食管腺癌的系列演變過程。研究認為胃食管反流物的刺激導致BE的發(fā)生，胃酸與膽鹽是反流物的主要成分，以往研究認為胃酸與GERD、BE的嚴重程度密切相關，而膽鹽在BE發(fā)生中的作用仍未引起足夠的重視。近期研究發(fā)現(xiàn)，膽鹽在BE相關腺癌的發(fā)病過程中起重要作用，但膽鹽引起B(yǎng)E發(fā)生的機制仍未完全明了。
　　KLF5(Krüppel-like factor5)是一種鋅指蛋白，屬于Sp/KLF蛋白家族，高表

3、達于腸道上皮細胞，是維持成人小腸的隱窩-絨毛軸所必需的因子，小腸絨毛的形成有賴于KLF5的調控;黏蛋白2(MUC2)大量表達于杯狀細胞，被認為是杯狀細胞的特異性標志物，MUC2也可在臨床病理診斷中作為Barrett食管杯狀細胞的分子標志;CDX2是一種核轉錄因子，在腸道上皮的生長、增殖以及分化過程中具有重要作用，它也是Barrett食管特征性表達因子之一;已有研究表明，膽酸能上調正常食管細胞系中腸化標志物CDX2和杯狀細胞標志物MUC2

4、表達。小腸絨毛標志物VILLIN是一種肌動蛋白粘連蛋白，特異性表達于小腸絨毛刷狀緣;研究發(fā)現(xiàn)VILLIN在BE及食管腺癌病組織表達量較高。所以，MUC2、CDX2、VILLIN等腸道重要標志物都與Barrett食管的形成相關，而KLF5可以促進小腸的生長發(fā)育、調控小腸絨毛的形成，與MUC2、CDX2及VILLIN等腸道標志物密切相關;但KLF5是否通過調控上述腸道標志物介導BE組織形成，迄今尚無研究報道。
　　本課題采集正常人群、

5、臨床診斷食管炎、BE人群食管組織標本，并構建大鼠食管炎及Barrett食管動物模型，進行免疫組化實驗，旨在探討KLF5是否與Barrett食管相關;用DCA處理食管鱗狀上皮細胞株HET-1a細胞模擬體外反流實驗，探討KLF5是否參與腸化的形成過程;干擾及過表達正常食管細胞中KLF5，探討KLF5對MUC2、CDX2及VILLIN等腸化標志物的調節(jié)作用。揭示了在DCA誘導下KLF5可以通過調節(jié)MUC2、CDX2及VILLIN等因子的表達，

6、導致食管鱗狀上皮細胞轉分化為柱狀上皮表型。
　　方法：
　　1.飼養(yǎng)Sprague-Dawley(SD)大鼠，并施以外科手術構建膽酸反流模型，取其食管組織，制成免疫組化切片;
　　2.收集第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院2013年3月至2013年12月的反流性食管炎(RE)標本59例，短段BE標本21例;
　　3.免疫組化檢測人和老鼠的食管鱗狀上皮、食管炎及BE組織中KLF5、MUC2、VILLIN、CDX2在組織中蛋白

7、表達水平;
　　4.培養(yǎng)人食管鱗狀上皮細胞(HET-1a)，用濃度為200umol/L的去氧膽酸(DCA)按不同時間點處理HET-1a細胞，分別為0h、2h、4h、8h、12h;
　　5.Real-time PCR（實時熒光定量PCR）、Western blot檢測DCA處理后，各時間點HET-1a細胞內KLF5、VILLIN、 MUC2及CDX2的mRNA及蛋白表達水平;
　　6.下調KLF5后，Real-time

8、PCR(實時熒光定量PCR)、Western blot檢測細胞中KLF5、MUC2、CDX2及VILLIN的mRNA及蛋白水平表達情況;
　　7.過表達KLF5，采用Real-time PCR、Western blot檢測在細胞內KLF5、VILLIN、MUC2及CDX2的mRNA及蛋白表達水平;
　　8.免疫熒光檢測上述處理后HET-1a細胞內KLF5、VILLIN、MUC2及CDX2的蛋白表達情況。
　　結果：

9、r>　　1.免疫組化結果顯示，在人類及大鼠BE食管上皮組織中KLF5、VILLIN、MUC2、及CDX2的表達呈強陽性，在食管炎中表達呈弱陽性或不表達，而在正常食管中表達呈陰性;
　　2.HET-1a細胞經(jīng)DCA處理后，Real-time及Western blot檢驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比隨著處理時間的延長，KLF5、VILLIN、MUC2、及CDX2的mRNA及蛋白水平的表達也呈上升趨勢;
　　3.siRNA干擾細胞后，Rea

10、l-time及Western blot檢驗發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比食管鱗狀上皮細胞中VILLIN、MUC2、及CDX2的mRNA及蛋白表達受到抑制，且對DCA誘導上述因子的表達也有明顯的抑制作用;
　　4.慢病毒過表達KLF5后，Real-time及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)腸道標志物VILLIN、MUC2、及CDX2的mRNA及蛋白與陰性對照相比表達也明顯增加。
　　5.經(jīng)過上述1，2，3，4相同處理因素后，免疫熒光實

11、驗檢測HET-1a細胞內KLF5、MUC2、CDX2、VILLIN的蛋白表達趨勢，檢測結果與上述實驗結果一致。
　　結論：
　　1.KLF5在大鼠和人BE組織中的表達明顯高于食管炎癥以及正常組織，說明KLF5與Barrett食管相關。
　　2.DCA處理HET-1a細胞后，隨著處理時間的延長，KLF5以及MUC2、CDX2以及VILLIN的腸道標志物的表達明顯增加，這在細胞實驗上進一步證明了KLF5與Barrett食管

12、的形成相關，且DCA能誘導KLF5、MUC2、CDX2、VILLIN的表達。
　　3.抑制HET-1a細胞內KLF5的表達，MUC2、CDX2以及VILLIN表達也明顯下調，說明KLF5可能位于它們的上游，并能調控它們的表達。
　　4.上調HET-1a細胞內KLF5的表達發(fā)現(xiàn)MUC2、CDX2以及VILLIN表達明顯增高，說明KLF5能夠誘導上述因子的表達。
　　以上發(fā)現(xiàn)提示，KLF5在DCA的介導下可誘導CDX2、M