油菜BN5和BN10基因的誘導(dǎo)表達(dá)和病毒抗性鑒定及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、油菜是我國(guó)重要的油料作物。病毒病是危害油菜的主要病害，蕪菁花葉病毒(TuMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、油菜花葉病毒(YoMV)和煙草花葉病毒(TMV)是油菜病毒病的主要毒源。在油菜生產(chǎn)上，種植抗病品種是防治病毒病的有效措施，但目前尚缺乏對(duì)病毒病高抗或免疫的油菜品種，并且寄主對(duì)病毒病抗性的分子機(jī)制研究相對(duì)滯后。
　　 本研究利用基于病害防御反應(yīng)信號(hào)分子誘導(dǎo)處理的油菜葉片制備的UniGene庫(kù)和對(duì)應(yīng)的油菜cDNA芯片，通過(guò)基因表達(dá)

2、譜分析和序列分析，結(jié)合參閱相關(guān)文獻(xiàn)，挑選出與抗病抗逆相關(guān)的油菜BN5基因和BN10基因；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的泡花法(Floral-dip)將油菜BN5和BN10基因轉(zhuǎn)化到Columbia野生型擬南芥；利用熒光定量PCR檢測(cè)BN5和BN10基因在油菜不同組織中的表達(dá)差異，以及病毒和化學(xué)處理對(duì)該基因的誘導(dǎo)表達(dá)。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1．YoMV、TuMV和CMV三種病毒在油菜感病品種華雜6號(hào)上活化后的病狀表現(xiàn)基本一致，表現(xiàn)為花

3、葉、斑駁、皰斑、明脈和皺縮等癥狀。病毒接種鑒定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)BN5基因RNAi載體的轉(zhuǎn)基因油菜（pRNAi-BN5）比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨ㄌK油1號(hào)）對(duì)病毒更敏感。在三種油菜病毒中，轉(zhuǎn)基因油菜對(duì)CMV最為敏感，接種CMV后發(fā)病最重，其次是YoMV和TuMV。
　　 2．pRNAi-BN5轉(zhuǎn)基因油菜中BN5基因熒光定量PCR分析表明：BN5基因的表達(dá)受到明顯抑制，表達(dá)量?jī)H為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?2％-45%。BN5基因在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因油菜根、莖

4、、葉中均有表達(dá)，其中在莖的表達(dá)量最高，葉居中，根的表達(dá)量最低。油菜接種YoMV、CMV和TuMV，不管是轉(zhuǎn)基因油菜還是非轉(zhuǎn)基因油菜，三種病毒均能誘導(dǎo)BN5基因的上調(diào)表達(dá)，但不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量和上調(diào)表達(dá)幅度有所不同。三種病毒中，接種CMV時(shí)BN5的誘導(dǎo)表達(dá)量最高，且最先達(dá)到峰值，但之后迅速下降，降幅大于接種YoMV和TuMV時(shí)BN5的表達(dá)量。說(shuō)明BN5基因?qū)MV的刺激最敏感，可能在油菜抗病毒過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
　　 3．BN

5、10基因在油菜根、莖、葉中均有表達(dá)，其中在根的表達(dá)量最高，莖居中，在葉中的表達(dá)量最低。用甲基茉莉酸(MeJA)和草酸(OA)處理油菜葉片，熒光定量PCR分析表明：MeJA誘導(dǎo)處理后BN10基因表達(dá)先升后降，在24h表達(dá)量最高（為誘導(dǎo)前的2.58倍），之后有所下降，但誘導(dǎo)后的表達(dá)量始終高于誘導(dǎo)前，72h時(shí)的表達(dá)量仍為誘導(dǎo)前的1.13倍。OA誘導(dǎo)處理后，BN10表達(dá)量也是先增加后降低，在12h達(dá)到最大值（為誘導(dǎo)前的2.5倍），72h下降至最

6、低（僅為誘導(dǎo)前的25%）。研究結(jié)果顯示，甲基茉莉酸和草酸均能誘導(dǎo)BN10的表達(dá)，推斷BN10可能在油菜抗逆過(guò)程中具有一定的作用。
　　 4．通過(guò)化學(xué)法（CaCl2法）將油菜BN5和BN10基因的RNAi載體和過(guò)表達(dá)載體，即pRNAi-BN5、pG4A-BN5、pRNAi-BNl0和pG4A-BNl04種質(zhì)粒DNA成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。通過(guò)除草劑篩選及PCR檢測(cè)，分別獲得含pRNAi-BN5、pG4A-BN5、pRNAi-B