油菜BN5和BN10基因的誘導表達和病毒抗性鑒定及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、油菜是我國重要的油料作物。病毒病是危害油菜的主要病害，蕪菁花葉病毒(TuMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、油菜花葉病毒(YoMV)和煙草花葉病毒(TMV)是油菜病毒病的主要毒源。在油菜生產(chǎn)上，種植抗病品種是防治病毒病的有效措施，但目前尚缺乏對病毒病高抗或免疫的油菜品種，并且寄主對病毒病抗性的分子機制研究相對滯后。
　　 本研究利用基于病害防御反應信號分子誘導處理的油菜葉片制備的UniGene庫和對應的油菜cDNA芯片，通過基因表達

2、譜分析和序列分析，結(jié)合參閱相關(guān)文獻，挑選出與抗病抗逆相關(guān)的油菜BN5基因和BN10基因；利用農(nóng)桿菌介導的泡花法(Floral-dip)將油菜BN5和BN10基因轉(zhuǎn)化到Columbia野生型擬南芥；利用熒光定量PCR檢測BN5和BN10基因在油菜不同組織中的表達差異，以及病毒和化學處理對該基因的誘導表達。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1．YoMV、TuMV和CMV三種病毒在油菜感病品種華雜6號上活化后的病狀表現(xiàn)基本一致，表現(xiàn)為花

3、葉、斑駁、皰斑、明脈和皺縮等癥狀。病毒接種鑒定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)BN5基因RNAi載體的轉(zhuǎn)基因油菜（pRNAi-BN5）比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨ㄌK油1號）對病毒更敏感。在三種油菜病毒中，轉(zhuǎn)基因油菜對CMV最為敏感，接種CMV后發(fā)病最重，其次是YoMV和TuMV。
　　 2．pRNAi-BN5轉(zhuǎn)基因油菜中BN5基因熒光定量PCR分析表明：BN5基因的表達受到明顯抑制，表達量僅為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?2％-45%。BN5基因在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因油菜根、莖

4、、葉中均有表達，其中在莖的表達量最高，葉居中，根的表達量最低。油菜接種YoMV、CMV和TuMV，不管是轉(zhuǎn)基因油菜還是非轉(zhuǎn)基因油菜，三種病毒均能誘導BN5基因的上調(diào)表達，但不同時間點的表達量和上調(diào)表達幅度有所不同。三種病毒中，接種CMV時BN5的誘導表達量最高，且最先達到峰值，但之后迅速下降，降幅大于接種YoMV和TuMV時BN5的表達量。說明BN5基因?qū)MV的刺激最敏感，可能在油菜抗病毒過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 3．BN

5、10基因在油菜根、莖、葉中均有表達，其中在根的表達量最高，莖居中，在葉中的表達量最低。用甲基茉莉酸(MeJA)和草酸(OA)處理油菜葉片，熒光定量PCR分析表明：MeJA誘導處理后BN10基因表達先升后降，在24h表達量最高（為誘導前的2.58倍），之后有所下降，但誘導后的表達量始終高于誘導前，72h時的表達量仍為誘導前的1.13倍。OA誘導處理后，BN10表達量也是先增加后降低，在12h達到最大值（為誘導前的2.5倍），72h下降至最

6、低（僅為誘導前的25%）。研究結(jié)果顯示，甲基茉莉酸和草酸均能誘導BN10的表達，推斷BN10可能在油菜抗逆過程中具有一定的作用。
　　 4．通過化學法（CaCl2法）將油菜BN5和BN10基因的RNAi載體和過表達載體，即pRNAi-BN5、pG4A-BN5、pRNAi-BNl0和pG4A-BNl04種質(zhì)粒DNA成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。通過除草劑篩選及PCR檢測，分別獲得含pRNAi-BN5、pG4A-BN5、pRNAi-B