鴨腎間充質(zhì)干細(xì)胞建系及普伐他汀對(duì)其增殖的影響.pdf

1、目的：建立北京鴨腎間充質(zhì)干細(xì)胞(Nephric Mesenchymal Stem Cells，NMSCs）的體外培養(yǎng)體系，研究其生物學(xué)特性，探究普伐他汀對(duì)鴨腎間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用的影響。
　　方法：⑴NMSCs的分離培養(yǎng)：以15日齡北京鴨胚胎腎為研究材料，采用混合酶消化法獲得NMSCs，并進(jìn)行傳代、凍存和復(fù)蘇。⑵NMSCs生物學(xué)特性研究：形態(tài)學(xué)觀察；繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算群體倍增時(shí)間；特異性表面標(biāo)志物RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)；多

2、向分化潛能鑒定：將NMSCs定向誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝樣細(xì)胞和上皮細(xì)胞，并對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行特異性染色、RT-PCR和免疫熒光鑒定。⑶普伐他汀對(duì)NMSCs增殖作用研究：將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組向培養(yǎng)基中分別加入0.001、0.01、0.1、1、10μmol?L-1五種濃度的普伐他汀，觀察藥物作用后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；MTS比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；增殖基因熒光定量PCR檢測(cè)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞特異性標(biāo)記抗原和增殖核抗原的陽

3、性率。
　　結(jié)果：①北京鴨胚胎NMSCs傳至23代，呈長梭形，具有較強(qiáng)的增殖能力。②細(xì)胞生長曲線呈典型的“S”型，經(jīng)歷潛伏期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期，符合細(xì)胞體外生長的一般規(guī)律，細(xì)胞的群體倍增時(shí)間分別為31.85、35.07、40.98h。③RT-PCR檢測(cè)NMSCs陽性表達(dá)Vimentin、Fibronectin、CD29、CD71、CD44和CD73，陰性表達(dá)CD34和CD45，免疫熒光檢測(cè)NMSCs陽性表達(dá)Vimentin、

4、CD29、CD71和CD44。④成功地將NMSCs誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝樣細(xì)胞和上皮細(xì)胞。⑤普伐他汀作用76 h后細(xì)胞呈長梭形，形態(tài)無明顯變化。⑥經(jīng)MTS檢測(cè)，與對(duì)照組比較，普伐他汀組濃度為0.01、0.1、1μmol?L-1均可促進(jìn)NMSCs增殖，濃度為0.001μmol?L-1對(duì)NMSCs增殖影響較小，10μmol?L-1對(duì)NMSCs無促增殖作用。⑦與對(duì)照組比較，普伐他汀組濃度為0.001、0.01、0.1μmol?L-1時(shí)增

5、殖基因Ki67的相對(duì)表達(dá)量升高，0.01、0.1、1μmol?L-1時(shí)增殖基因 PCNA的相對(duì)表達(dá)量升高，其他濃度組與對(duì)照組相比差異不顯著。⑧NMSCs經(jīng)0.1μmol?L-1普伐他汀作用1 w后，細(xì)胞表面標(biāo)記抗原的表達(dá)量無明顯差異。Vimentin陽性率對(duì)照組為98.51％，實(shí)驗(yàn)組為97.43%；CD44陽性率對(duì)照組為97.21%，實(shí)驗(yàn)組為97.78%；細(xì)胞增殖核抗原的表達(dá)量增加，Ki67陽性率對(duì)照組為2.39%，實(shí)驗(yàn)組為12.3%；

6、PCNA陽性率對(duì)照組為11.07%，實(shí)驗(yàn)組為26.14%。
　　結(jié)論：成功建立了北京鴨胚胎腎間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，并對(duì)NMSCs自我增殖和多向分化潛能進(jìn)行鑒定，證實(shí)體外培養(yǎng)NMSCs為鴨胚胎腎來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，與已知的間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特性。普伐他汀對(duì)NMSCs作用后不影響其細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特性，普伐他汀濃度為0.001~1μmol?L-1時(shí)可促進(jìn)NMSCs增殖，濃度為10μmol?L-1對(duì)NMSCs沒有促增殖作用